申请/专利权人：天津市农业科学院

申请日：2019-07-23

公开（公告）日：2023-05-12

公开（公告）号：CN110295192B

主分类号：C12N15/82

分类号：C12N15/82;A01H5/00;A01H6/82

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.05.12#授权;2019.11.01#实质审查的生效;2019.10.01#公开

摘要：本发明公开了一种利用Gateway技术构建TYLCV和ToCV的双价RNAi表达载体及其应用。其中的双价RNAi表达载体，命名为pRNAi‑TOCV‑TY。所述RNAi表达载体的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。本发明利用RNAi技术进行了大量的研究工作，通过Gateway技术，构建了TYLCV和ToCV的外壳蛋白基因双价RNAｉ表达载体，通过遗传转化、抗性鉴定等实验方法获得了抗两种病毒的转基因番茄植株。本发明进一步公开了pRNAi‑TOCV‑TY表达载体在有效防治ToCV和TYLCV的复合侵染番茄方面的应用。特别是pRNAi‑TOCV‑TY表达载体有效阻碍番茄病毒在植株体内的复制方面的应用。

主权项：1.一种利用Gateway技术构建的TYLCV和ToCV双价RNAi表达载体，其命名为pRNAi-TOCV-TY；所述表达载体的构建方法如下：1番茄叶片核酸的提取:采集TYLCV发病的番茄叶片，提取总DNA；采集ToCV发病的番茄叶片,采用大连宝生物公司TaKaRaRNA提取试剂盒提取RNA，以随机引物OligodT进行反转录合成cDNA；（2）ToCV和TYLCVCP基因片段的获得分别选择ToCV和TYLCV的CP基因保守序列区域设计合成引物，引物ToCV-FR扩增ToCV的CP片段；引物TY-FR扩增TYLCV的CP片段；引物ToCV-F的序列如SEQIDNO.1所示；引物ToCV-R的序列如SEQIDNO.2所示；引物TY-F的序列如SEQIDNO.3所示；引物TY-R的序列如SEQIDNO.4所示；（3）ToCV和TYLCVCP两个基因串联片的获得将得到的TYLCVCP和ToCVCP的PCR产物混合，利用引物ToCV-Ｆ和TY-Ｒ进行PCR扩增，得到TYLCVCP和ToCVCP的串联基因ToCV-TY片段，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳，回收获得的串联基因片段合名为TOCV-TY，将TOCV-TY连接转入pMD18-T载体，获得重组质粒P-ToCV-TY；（4）带attB接头串联基因的获得以重组质粒P-ToCV-TY为模板，用attB-ToCV-F和attB-TY-R引物进行PCR，将B序列分别加到串联基因的上游和下游；attB-ToCV-F的序列如SEQIDNO.5所示；attB-TY-R的序列SEQIDNO.6所示；（5）利用Gateway技术获得入门载体将带有attB接头的PCR产物纯化，回收并测序，利用此PCR产物与pDONRTM221Vector进行BP反应，获得入门载体pDONR221-TOCV-TY，将反应的溶液转化DH5α，37℃培养16h后，利用M13FR引物进行PCR检测，筛选阳性克隆，将得到的阳性克隆进行测序鉴定；M13F的序列如SEQIDNO.9所示；M13R的序列如SEQIDNO.10所示；鉴定正确的克隆命名为pENTR-TOCV-TY；（6）表达载体的获得将获得的入门克隆载体pENTR-TOCV-TY与表达载体pK7GWIWG2I进行LR反应，按照LRClonaseIIenzymeMix试剂盒说明书构建10μL反应体系，25℃放置1小时，加入1μlProteinaseK，混匀，37℃10min，获得pK7GWIWG2I-TOCV-TY表达载体，将反应产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化细胞均匀涂布在含有50ugml壮观霉素的LB固体培养基上，37℃培养16h后，挑单克隆到含有相同浓度的壮观霉素的LB液体培养基中，37℃震荡培养16h后，用引物p35S和TY-R进行菌落PCR；用P35SP和T35SP进行正反向测序，选择正确方向的阳性克隆，即为RNAi表达载体命名为pRNAi-TOCV-TY；P35S的序列如SEQIDNO.7所示；T35SP的序列如SEQIDNO.8所示。

全文数据：利用Gateway技术构建TYLCV和ToCV的双价RNAi表达载体及其应用技术领域本发明提供一种利用Gateway技术快速、简捷地构建抗TYLCV和ToCV病毒双价RNAi表达载体，并用于抑制这两种病毒的侵染，从而培育出双抗的植物新材料。属基因工程技术领域。背景技术番茄（LycopersiconesculentumMill.）是我国设施栽培的主要蔬菜作物之一，在蔬菜周年供应上占有重要地位。但随着番茄种植面积的日趋扩大和引种渠道的多样化，番茄病毒病也日益严重，成为制约番茄发展的瓶颈。目前，番茄褪绿病毒（Tomatochlorosisvirus,ToCV）和番茄黄化曲叶病毒（Tomatoyellowleafcurlvirus,TYLCV）对番茄危害最为严重，且经常出现复合侵染的情况，加重病症，造成产量和质量的严重下降。目前，对番茄黄化曲叶病毒主要是利用野生抗性资源培育抗病品种。而这种方法对番茄褪绿病毒却无能为力，因为到目前为止，在世界范围内还未找到对这一病毒的抗性基因。所以培育抗番茄褪绿病毒已成为亟待解决的难题。近年来，利用RNAi沉默技术作为一种抵抗外来基因入侵的防御方式成为基因工程抗病育种中的最为有效的一种方法。构建植物RNAi表达载体的方法基本分为两种,一种为以酶切连接为基础的传统的植物RNAi表达载体构建；另一种以同源重组为基础的植物RNAi表达载体构建。以Gateway为代表的同源重组RNAi表达载体构建方法，以其高效、快捷的特点而广泛得到应用。用该方法培育抗病毒品种的研究也有报道如Kamachi等利用黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）的外壳蛋白基因得到了稳定的抗病株系；颜培强等利用TMV的外壳蛋白基因构建RNAi载体并转化到烟草中，转基因植株表现了良好的抗性。但在番茄上，TYLCV和ToCV经常发生复合感染，必须构建抗两种病毒沉默载体才能培育出多种抗性的番茄材料。本发明利用Gateway技术，构建TYLCV和ToCV的外壳蛋白基因保守区段的双价RNAi植物表达载体，进一步转化番茄培育抗病毒材料，为番茄的抗病育种提供新资源。发明内容番茄黄化曲叶病毒和番茄褪绿病毒经常发生复合侵染的现象。因为番茄褪绿病毒无抗源，所以目前对该病的防治只能是防止烟粉虱的传播，但烟粉虱体积小，抗药性强，在番茄生产上，这种方法很难奏效。针对上述问题，发明人利用RNAi技术进行了大量的研究工作，通过Gateway技术，构建了TYLCV和ToCV的外壳蛋白基因双价RNAi表达载体，通过遗传转化、抗性鉴定等实验方法获得了抗两种病毒的转基因番茄植株。为实现上述目的，本发明公开了一种利用Gateway技术构建的TYLCV和ToCV双价RNAi表达载体，其命名为pRNAi-TOCV-TY。所述RNAi表达载体的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示：RNAi序列：atggagaacagtgctgttgcaaacactggtgataacggtggtggccgcaatcctctggttagaccgttagatgatggcgtagatgacgaggtgcagaacttgggcaggagggacgattcgacatctcttattccggctaatcctaatcgatcttccagttgggctttgttgaacccggatactattaattataacgagttaaggaaattgaaggtacactccactaggggtgatactcttaccttgactcaggaagaggagttcgagaagatactcgaatccttttgcaggcgaataatcggtgagaccccgatgacggataagattttcgctggtttctacatgtctatgtgtcaggccattgtaaaccaagggacctcagttaaagcacccggtaataacagtcttgaaaactactttgaggtagatggtgatgtcgaagcgaccaggcgatataatcatttccacgcccgcctcgaaggttcgccgaaggctgaacttcgacagcccatacagcagccgtgctgctgtccccattgtccaaggcacaaacaagcgacgatcatggacgtacaggcccatgtaccggaagcccagaatatacagaatgtatcgaagccctgatgttcctcgtggatgtgaaggcccatgtaaagtccagtcttatgagcaacgggatgatattaagcatactggtattgttcgttgtgttagtgatgttactcgtggatctggaattactcacagagtgggtaagaggttctgtgttaaatcgatatattttttaggtaaagtctggatggatgaaaatatcaagaagcagaatcacactaatcagg本发明进一步公开了pRNAi-TOCV-TY表达载体的构建方法，其特征在于按如下的步骤进行：1番茄叶片核酸的提取:采集TYLCV发病的番茄叶片,提取总DNA；采集ToCV发病的番茄叶片,采用大连宝生物公司（TaKaRa）RNA提取试剂盒提取RNA，以随机引物OligodT进行反转录合成cDNA。（2）ToCV和TYLCVCP基因片段的获得分别选择ToCV和TYLCV的CP基因保守序列区域设计合成引物，如SEQIDNO.1-4，引物ToCV-FR扩增ToCV的CP片段；引物TY-FR扩增TYLCV的CP片段；（3）ToCV和TYLCVCP两个基因串联片的获得将得到的TYLCVCP和ToCVCP的PCR产物混合，再利用引物ToCV-Ｆ和TY-Ｒ进行PCR扩增，得到TYLCVCP和ToCVCP的串联基因ToCV-TY片段，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳，回收获得的串联基因片段合名为TOCV-TY，将TOCV-TY连接转入pMD18-T载体，获得重组质粒P-TOCV-TY；（4）带attB接头串联基因的获得以重组质粒P-ToCV-TY为模板，用attB-TOCV-F和attB-TY-R引物进行PCR，将B序列分别加到串联基因的上游和下游；（5）利用Gateway技术获得入门载体将带有attB接头的PCR产物纯化，回收并测序，利用此PCR产物与pDONRTM221Vector进行BP反应，获得入门载体pDONR221-TOCV-TY，将反应的溶液转化DH5α，37℃培养16h后，利用M13FR引物进行PCR检测，筛选阳性克隆，将得到的阳性克隆进行测序鉴定；（6）表达载体的获得将获得的入门克隆与表达载体pK7GWIWG2I0进行LR反应，获得pK7GWIWG2I0-TOCV-TY表达载体，即为RNAi表达载体命名为pRNAi-TOCV-TY，将反应产物转化大肠杆菌DH5α，利用引物p35S和TY-R进行菌落PCR。阳性菌落用引物P35SP和T35SP进行正反向测序来验证联接方向的正确性。从阳性克隆且方向正确的菌落中提取pRNAi-TOCV-TY质粒，转化农杆菌GV3101；本发明更进一步公开了TYLCV和ToCV双价RNAi表达载体pRNAi-TOCV-TY在有效防治ToCV和TYLCV的复合侵染番茄方面的应用。所述的有效防治ToCV和TYLCV的复合侵染番茄指的是有效阻碍番茄病毒在植株体内的复制。实验结果显示：将转基因番茄植株用携带ToCV和TYLCV的烟粉虱种群接种后，转基因植株表现出了高效沉默ToCV和TYLCV病毒的靶标CP基因，同时有部分转基因植株表现延迟抗病。转ToCVCP基因和TYLCVCP基因的双价RNAi番茄植株有效阻碍了病毒在植株体内的复制，为防治ToCV和TYLCV的复合侵染番茄提供了一种新的思路和实践方法。本发明主要解决了番茄生产上ToCV和TYLCV复合侵染的重大病害阻碍番茄产业的发展的现实问题，重点考察了ToCV和TYLCV不同编码基因和不同干扰片段的长度对沉默外源病毒侵染的效果，主要的难点在于：两个基因片段的串联RNAi表达载体的构建及转基因植株的获得。本发明公开的利用Gateway技术构建TYLCV和ToCV的双价RNAi表达载体的方法与现有技术相比所具有的积极效果在于：（1）解决了长期以来对TYLCV和ToCV的防治主要是利用化学药剂杀死虫传媒介烟粉虱对环境的污染及对食品安全的威胁。（2）因世界范围内尚未从番茄资源中找到对ToCV的抗性基因，利用RNAi技术获得的抗RNAi的创新材料有效解决该问题。附图说明图1ToCV和TYLCVCP基因片段扩增；MDL2000；1.ToCVCP片段；2.TYLCVCP片段；图2ToCV-TY串联基因的PCR鉴定；M．DL2000；1.ToCV-F和TY-R为引物的PCR产物；图3入门载体的PCR鉴定；M．DL2000；1.M13FM13R扩增产物图4pRNAi-TOCV-TY转化农杆菌GV3101的PCR鉴定；M.DL2000;1-2.P35S和TY-R引物扩增；图5根癌农杆菌转化番茄；A.子叶转化；B.下胚轴转化；C.诱导不定芽；D.诱导不定根；E.再生植株；图6转基因植株的PCR检测；M.DL2000;1-2.P35S和TY-R引物扩增图7接种TYLCV的表现；1.对照植株;2-5.抗病转基因植株；图8叶片表现；1.抗病转基因植株新叶;２.对照植株新叶；3.对照植株老叶；4.抗病转基因植株老叶；图9病毒分子检测；A．TY-FR引物PCR扩增；B．ToCVCPFR引物PCR扩增；M.DL20001.对照植株;2-6.4、9、10、11、13；7-13.1、2、3、5、8、12、14。具体实施方式下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。实施例11材料和方法1.1材料在天津市西青区第六阜日光温室番茄栽培田中，采集具有典型特征的番茄黄化曲叶病毒和番茄褪绿病毒的番茄叶片，用于核酸提取的后续试验。番茄感病自交系J501为本研究室保存。pDONRTM221Vector、BPClonaseIIenzymeMix、LRClonaseIIenzymeMix、反转录酶购自美国Invitrogen公司。rTaqDNA聚合酶、dNTPs、DNA回收纯化试剂盒、RNA提取试剂盒购自大连宝生物工程有限公司，质粒小量提取试剂盒和农杆菌GV3101购自天根生化科技有限公司。PCR引物均由大连宝生物工程有限公司合成。pK7GWIWG2I、2×SGPCRMasterMix为北京信诺金达生物科技有限公司产品。携带有TYLCV和ToCV的烟粉虱群体来自天津市农业生物技术研究中心饲养在养虫室的番茄苗上。1.2方法1.2.1核酸提取取TYLCV发病植株的叶片，CTAB法提取总DNA；取ToCV发病植株的叶片，采用大连宝生物公司（TaKaRa）RNA提取试剂盒提取RNA，以随机引物OligodT进行反转录合成cDNA。1.2.2ToCV和TYLCVCP基因片段的获得分别选择ToCV和TYLCV的CP基因保守序列区域设计合成引物（表1）。引物ToCV-FR扩增ToCVCP片段；引物TY-FR扩增TYLCV的CP片段。PCR总体积为25μL，其中包括10×反应缓冲液（含Mg2＋）2.5μL，dNTP混合物（2.5mmolL）0.5μL，上游引物（10μmolL）2.5μL，下游引物（10μmolL）2.5μL，模板0.5-2μL，DNA聚合酶（5UμL）0.5μL，其余用水补足。反应程序:94℃变性５min，94℃30s，54℃30s，72℃1.5min，35个循环；72℃延伸10min。将目标条带分别用DNA回收纯化试剂盒回收，测序并分析。1.2.3ToCV和TYLCVCP两个基因串联片的获得将得到的TYLCVCP和ToCVCP的PCR产物混合，再利用引物ToCV-Ｆ和TY-Ｒ进行PCR扩增，得到TYLCVCP和ToCVCP的串联基因ToCV-TY片段。PCR总体积为50μL，其中2×SGPCRMasterMix25μL，模板各1μL，上下游引物各1μL，其余用水补足。反应程序为：94℃变性2min；94℃30s，5４℃30s，72℃1.5min，35个循环；72℃延伸10min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳，回收获得的串联基因片段合名为TOCV-TY，将TOCV-TY连接转入pMD18-T载体，获得重组质粒P-TOCV-TY。1.2.4带attB接头串联基因的获得以重组质粒P-ToCV-TY为模板，用attB-TOCV-F和attB-TY-R引物进行PCR，将B序列分别加到串联基因的上游和下游。反应体系：PCR总体积为50μL，其中2×SGPCRMasterMix25μL，模板1μL，上下游引物各1μL，其余用水补足。反应程序为：94℃变性2min；94℃30s，55℃30s，72℃1.5min，35个循环；72℃延伸10min。表1本研究中用到的PCR引物1.2.5利用Gateway技术获得入门载体将带有attB接头的PCR产物纯化，回收并测序。利用此PCR产物与pDONRTM221Vector进行BP反应，按照BPClonaseIIenzymeMix试剂盒说明书，构建10μL体系，25℃放置1小时，加入1μlProteinaseK，混匀，37℃10min。将反应的溶液转化DH5α感受态细胞。将转化细胞均匀涂布在含有50ugml卡那霉素的LB培养基上，37℃培养16h后，挑单克隆到含有相同浓度的卡那霉素的LB液体培养基中，37℃震荡培养16h后，利用M13FR引物进行PCR检测，筛选阳性克隆，将得到的阳性克隆进行测序鉴定，鉴定正确的克隆命名为pENTR-TOCV-TY。1.2.6表达载体的获得将获得的入门克隆载体pENTR-TOCV-TY与表达载体pK7GWIWG2I进行LR反应，按照LRClonaseIIenzymeMix试剂盒说明书构建10μL反应体系，25℃放置1小时，加入1μlProteinaseK，混匀，37℃10min，获得pK7GWIWG2I-TOCV-TY表达载体，将反应产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化细胞均匀涂布在含有50ugml壮观霉素的LB固体培养基上，37℃培养16h后，挑单克隆到含有相同浓度的壮观霉素的LB液体培养基中，37℃震荡培养16h后，用引物p35S和TY-R进行菌落PCR。用P35SP和T35SP进行正反向测序，选择正确方向的阳性克隆，即为RNAi表达载体命名为pRNAi-TOCV-TY。1.2.7农杆菌的获得从含有pRNAi-TOCV-T表达载体的DH5α中提取质粒，用冻融法转化农杆菌GV3101，转化细胞均匀涂布于含有壮观霉素（Spe，50ugml）和利福平Rif，50ugml的YEB固体培养基上，28℃培养2天后，挑单克隆到含有相同浓度的壮观霉素（Spe，50ugml）和利福平Rif，50ugml的YEB液体培养基中，28℃培养2天后，分别用特异引物p35S和TY-R进行菌液PCR，鉴定阳性克隆。该表达载体转化番茄后，将会形成发卡RNA结构，从而达到干扰病毒RNA复制的效果。1.2.8农杆菌转化番茄及转基因植株的鉴定利用农杆菌介导的叶盘转化法转化番茄。番茄感病自交系J501种子用70％乙醇浸泡30min，然后用10％次氯酸钠消毒６min，随后用无菌水冲洗3遍，接种于MS培养基上培养两周；取无菌番茄苗的子叶或下胚轴为外植体，用OD600=0．5左右的农杆菌菌液浸泡外植体5min。取出外植体，置于无菌滤纸上吸干残留菌液，转入含有IAA（O．2mg／L）和6-BA（2．0mg／L）的MS培养基上共培养3天，然后转入含有头孢霉素（500mg／L）和卡那霉素（50mg／L）的筛选培养基上进行培养，每２周继代一次。再生芽长到3cm左右时转入含有（IBA1．0mg／L）和头孢霉素（400mg／L）的1／2MS生根培养基中；根系发达后移栽至土壤。用CTAB法提取番茄再生植株叶片总DNA，用引物p35S和TY-R进行PCR检测，非转化番茄为对照。1.2.9烟粉虱传毒接种鉴定转基因番茄抗病性将对照及阳性转基因植株定植到防虫温室内。待长至4叶1心期叶和对照一起置于养虫网内，网内有携带TYLCV和ToCV的烟粉虱群体，进行虫传接种。接种一周后移出喷施杀虫剂，随后将番茄定植于花盆内，定期观察发病情况。接种15天和30天时进行PCR和RT－PCR检测，分别利用引物shanghaiFR和ToCVCPFR检测TYLCV和ToCV。结果与分析2.1ToCV和TYLCVCP基因片段的克隆分别以感染ToCV和TYLCV病毒的植物总RNA和总DNA为模板进行特异性的RT-PCR和PCR反应，分别获得了433bp和406bp的两个保守片段（图1）。测序结果表明，与天津分离物的同源性一致为100%。和TYLCV串联基因片段的获得因为TY-F引物上有一段序列与ToCV的反向引物ToCV-R互补，所以扩增的2个片段的末端有互补序列，在混合后的扩增过程中，退火的时候可以互补。再以ToCV-F和TY-R为引物，进行PCR反应。一步获得大小为839bp的两个病毒基因串联序列TOCV-TY（图2）。表达载体构建将pDONR221载体与带attB位点的TOCV-TY串联基因PCR产物进行BP反应，得到pENTR-TYPCR载体。转化细菌后，利用引物M13FR进行菌落PCR鉴定，产物大小为1100bp，明显大于插入片段，说明串联基因片段ToCV-TY已连接进入载体（图3）。将获得的入门载体与表达载pK7GWIWG2I进行LR反应，获得pRNAi-TOCV-TY表达载体。将获得的表达载体转化DH5α。利用引物p35S和TY-R，进行菌落PCR验证，结果扩增出约1000bp条带的，明显大于插入片段，与预期大小一致。利用P35SP和T35SP进行正反向测序，结果表明方向和测序正确，表明RNAi载体构建成功。将pRNAi-TOCV-TY表达载体转化农杆菌菌株GV3101，用引物p35SP和TY-R进行鉴定扩增出预期条带，证明表达载体成功转入农杆菌中（图4）2.４植物表达载体转化番茄通过农杆菌介导转化番茄J501子叶和下胚轴外植体，共获得30株再生植株。提取对照和再生植株基因组DNA，利用p35SP和TY-R引物进行PCR检测。结果显示，有15株能扩增出约1000bp左右的条带，而对照植株无扩增条带，说明该外源目的基因已整合到番茄基因组中。５转基因番茄抗病性鉴定本研究对15株阳性T0代转基因番茄植株进行了带毒烟粉虱接种鉴定，结果表明ToCV和TYLCV抗性在T0材料中得到了显著提升表1。接种15天时10株对照和15株转基因植株均未表现发病症状且用PCR进行分子检测也没有扩增出条带。在接种4周后，9株对照植株生长缓慢，老叶表现黄化，新叶表现出褶皱黄化，同时有5株转基因植株也有同样的症状（4、9、10、11、13），接种5-7周时又有3株显症（6、7、15）同时有1株对照也显症，其余的7株转基因植株在接种10周后均未有症状（1、2、3、5、8、12、14）。所以在T0转基因植株中，筛选出高抗TYLCV植株7株，占总调查株数的46.7％；延迟感病植株3株，占20％；感病植株5株，占30％。非转基因植株接种后无表现抗病的植株（图7、8）。初步表明本发明构建的双价RNAi载体能够高效沉默ToCV和TYLCV病毒的靶标基因CP基因。表2转基因植株的抗病性提取叶片总DNA和总RNA，利用TYLCV病毒的特异性引物shanghaiFR和ToCV的特异性引物ToCVCPFR分别进行PCR和RT-PCR检测。结果表明，接种病毒后的对照植株和发病植株能扩增出约575bp和840bp的目的条带，而表现抗病的转基因植株则未能扩增出该条带（图9）。本发明提供能够表达ToCVCP基因和TYLCVCP基因dsRNA的转基因番茄植株应用于ToCV和TYLCV的防治。将转基因番茄植株接种用携带ToCV和TYLCV的烟粉虱接种后，与对照处理相比，有46.7%的转基因植株表现出了高效沉默ToCV和TYLCV病毒的靶标CP基因，30%的转基因植株表现延迟抗病。转ToCVCP基因和TYLCVCP基因的双价RNAi番茄植株有效阻碍了病毒在植株体内的复制，为防治ToCV和TYLCV的复合侵染番茄提供了一种新的思路和实践方法。SEQUENCELISTING天津市农业生物技术研究中心利用Gateway技术构建TYLCV和ToCV的双价RNAi表达载体及其应用5PatentInversion3.5121DNA人工序列1atggagaacagtgctgttgca21220DNA人工序列2caccatctacctcaaagtag20339DNA人工序列3ctactttgaggtagatggtgatgtcgaagcgaccaggcg39420DNA人工序列4cctgattagtgtgattctgc205839DNA人工序列5atggagaacagtgctgttgcaaacactggtgataacggtggtggccgcaatcctctggtt60agaccgttagatgatggcgtagatgacgaggtgcagaacttgggcaggagggacgattcg120acatctcttattccggctaatcctaatcgatcttccagttgggctttgttgaacccggat180actattaattataacgagttaaggaaattgaaggtacactccactaggggtgatactctt240accttgactcaggaagaggagttcgagaagatactcgaatccttttgcaggcgaataatc300ggtgagaccccgatgacggataagattttcgctggtttctacatgtctatgtgtcaggcc360attgtaaaccaagggacctcagttaaagcacccggtaataacagtcttgaaaactacttt420gaggtagatggtgatgtcgaagcgaccaggcgatataatcatttccacgcccgcctcgaa480ggttcgccgaaggctgaacttcgacagcccatacagcagccgtgctgctgtccccattgt540ccaaggcacaaacaagcgacgatcatggacgtacaggcccatgtaccggaagcccagaat600atacagaatgtatcgaagccctgatgttcctcgtggatgtgaaggcccatgtaaagtcca660gtcttatgagcaacgggatgatattaagcatactggtattgttcgttgtgttagtgatgt720tactcgtggatctggaattactcacagagtgggtaagaggttctgtgttaaatcgatata780ttttttaggtaaagtctggatggatgaaaatatcaagaagcagaatcacactaatcagg839

权利要求：1.一种利用Gateway技术构建的TYLCV和ToCV双价RNAi表达载体，其命名为pRNAi-TOCV-TY；所述RNAi表达载体的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。2.权利要求1所述pRNAi-TOCV-TY表达载体的构建方法，其特征在于按如下的步骤进行：1番茄叶片核酸的提取:采集TYLCV发病的番茄叶片,提取总DNA；采集ToCV发病的番茄叶片,采用大连宝生物公司（TaKaRa）RNA提取试剂盒提取RNA，以随机引物OligodT进行反转录合成cDNA；（2）ToCV和TYLCVCP基因片段的获得分别选择ToCV和TYLCV的CP基因保守序列区域设计合成引物,如SEQIDNO.1-4所示，引物ToCV-FR扩增ToCV的CP片段；引物TY-FR扩增TYLCV的CP片段；（3）ToCV和TYLCVCP两个基因串联片的获得将得到的TYLCVCP和ToCVCP的PCR产物混合，利用引物ToCV-Ｆ和TY-Ｒ进行PCR扩增，得到TYLCVCP和ToCVCP的串联基因ToCV-TY片段，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳，回收获得的串联基因片段合名为TOCV-TY，将TOCV-TY连接转入pMD18-T载体，获得重组质粒P-ToCV-TY；（4）带attB接头串联基因的获得以重组质粒P-ToCV-TY为模板，用attB-ToCV-F和attB-TY-R引物进行PCR，将B序列分别加到串联基因的上游和下游；（5）利用Gateway技术获得入门载体将带有attB接头的PCR产物纯化，回收并测序，利用此PCR产物与pDONRTM221Vector进行BP反应，获得入门载体pDONR221-TOCV-TY，将反应的溶液转化DH5α，37℃培养16h后，利用M13FR引物进行PCR检测，筛选阳性克隆，将得到的阳性克隆进行测序鉴定；（6）表达载体的获得将获得的入门克隆与表达载体pK7GWIWG2I进行LR反应，获得pK7GWIWG2I-TOCV-TY表达载体，即为RNAi表达载体命名为pRNAi-TOCV-TY，将反应产物转化农杆菌GV3101，用于番茄的遗传转化。3.权利要求1所述TYLCV和ToCV双价RNAi表达载体pRNAi-TOCV-TY在有效防治ToCV和TYLCV的复合侵染番茄方面的应用。4.权利要求3所述的应用，其中所述的效防治ToCV和TYLCV的复合侵染番茄指的是有效阻碍番茄病毒在植株体内的复制。

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