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申请/专利权人：上海睿智化学研究有限公司;凯惠睿智生物科技(上海)有限公司

摘要：本发明公开了PDGFRβ单克隆重链抗体杂交瘤细胞及其制备方法和应用。该制备方法包括如下步骤：1制备免疫原，所述的免疫原的结构通式为：PDGFRβ胞外区域‑恒定区Fc；2利用免疫原免疫HCAb小鼠；3对HCAb小鼠进行1～7次加强免疫；4制备HCAb小鼠的脾细胞悬液并与小鼠骨髓瘤细胞融合得杂交瘤细胞；5鉴定杂交瘤细胞。将该杂交瘤用于PDGFRβ单克隆重链抗体的制备成本低、步骤简便，且抗体性质优异，能与人PDGFRβ的胞外区相结合，并高效抑制或阻断PDGFb与PDGFRβ结合，从而下调或切断相应的信号通路。

主权项：1.一种PDGFRβ单克隆重链抗体杂交瘤细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：1制备免疫原，所述的免疫原的结构通式为：PDGFRβ胞外区域-恒定区Fc；2利用所述免疫原免疫HCAb小鼠；3对所述HCAb小鼠进行1～7次加强免疫；4制备所述HCAb小鼠的脾细胞悬液并与小鼠骨髓瘤细胞融合得杂交瘤细胞；5鉴定杂交瘤细胞；所述PDGFRβ胞外区域的氨基酸序列如SwissProt数据库编号为P09619蛋白的第330-530位所示。

全文数据：PDGFRf^单克隆重链抗体杂交瘤细胞及其制备方法和应用技术领域[0001]本发明属于生物工程领域，具体涉及重链抗体转基因小鼠杂交瘤细胞及单克隆抗体的制备方法。背景技术[0002]血小板衍生生长因子Platelet-derivedgrowthfactor,F1DGF是普遍存在的一种由sis原癌基因编码的生长因子，最初从血小板α中分离得到，主要由巨核细胞合成，在组织损伤修复，血管生成和细胞分化过程中起到非常重要的作用。PDGF分子是一个糖蛋白二聚体，可分为-ΑΑ，_ΒΒ和-AB三种类型。PDGF及其受体（Platelet-derivedgrowthfactorreceptor，PDGFR在多种人体肿瘤中都有比较高的表达，如胰腺癌、小细胞肺癌、胃癌和乳腺癌等。PDGFR是一种位于细胞表面的受体酪氨酸激酶^Receptortyrosinekinase，RTK，可分为两个亚型：PDGFRa和roGFR0Matsuietal.1989JDGFRP可以特异性的与I3DGF-BB或-AB结合Herdaranetal.1991而被激活。被激活后，两个PDGFR之间可以形成二聚体，并通过自身磷酸化激活下游的信号转到通路，以实现其调控细胞分化生长的功能。PDGF信号传递已经在多种人类疾病中涉及，包括与病理学新血管形成相关的疾病、血管和纤维化疾病、肿瘤生长和眼病。因此，已经提出PDGF信号传递的抑制剂用于多种治疗环境。例如，已经提议将PDGFRI3的抑制剂用于治疗多种疾病和病症。（Andrae等人（2008GenesDev2210:1276-1312JDGFRP抑制剂包括非特异性小分子酪氨酸激酶抑制剂诸如甲磺酸伊马替尼、苹果酸舒尼替尼和CP-673451，以及抗TOGFRP抗体参见，例如美国专利号7，060，271;5，882，644;7，740，850;和美国专利申请公开号20110177074。也已经提出将抗配体适配体例如抗PDGF-B用于治疗应用。然而，本领域存在对新的、高特异性和强有力的TOGF信号传递抑制剂的需求。[0003]目前的单克隆抗体大多来自于小鼠，因此抗体作为异源蛋白在人体内具有抗原性，极大地限制了它在临床治疗上的使用。为了克服这一缺点，人们提出了很多解决方案，包括人人或人八鼠杂交瘤技术、嵌合抗体技术、噬菌体展示技术。人人或人八鼠杂交瘤技术由于其技术难度已退出市场，现在主要是运用体外抗体工程方法制备人源化抗体，但是这类方法得到的抗体往往亲和力不佳，易聚集，而从体内制备人源化或全人源抗体具有高亲和力，良好的水溶性以及不易发生聚集的优点，因此从全人源抗体转基因小鼠制备人全源抗体最具有研发优势，也是今后抗体开发的主流。重链抗体是去除两条轻链的抗体，相比传统抗体，它更容易穿过血管壁和进入实体瘤内部，在研发抗肿瘤单抗药物方面更具优势，另外从重链抗体衍生而来的单域抗体是迄今为止发现的最小抗体分子，在肿瘤影像，治疗和诊断方面可得到广泛应用。基于重链抗体的模块化性质，更进一步的应用是制备同时针对两个不同靶抗原的双特异抗体。然而，目前最常用的产重链抗体的技术为免疫骆驼通过噬菌体展示筛选得到抗体，其成本较高，后期仍需进行人源化才能得到全人源的重链抗体，因此探索成本低、效率高、且所得抗体亲和力好、特异性高的单克隆重链抗体具有重要意义。发明内容[0004]本发明要解决的技术问题是克服现有技术中单克隆重链抗体的制备方法成本高、步骤繁琐以及现有的抗人血小板衍生生长因子β受体PDGFR®抗体特异性不高、亲和力低以及利用噬菌体展示筛选制备重链抗体成本高的特点提供了一种PDGFRP单克隆重链抗体杂交瘤细胞及其制备方法和应用。将所述杂交瘤及其制备方法应用于成本低、步骤简便，且该抗体能够与人I3DGFRe的胞外区相结合，并能够高效地抑制或阻断PDGFb与TOGFRP的结合，从而下调或切断相应的信号通路。[0005]目前的抗体为两条重链两条轻链的普通抗体形式，而重链抗体是一种缺失轻链的新型抗体形式，目前制备重链抗体的方法有免疫骆驼通过噬菌体展示筛选得到抗体，成本较高，后期仍需进行人源化才能得到全人源的重链抗体，目前国内没有全人源血小板衍生生长因子受体的重链抗体。PDGFRP重链抗体开发的另一个难点在于由于转基因小鼠与正常小鼠有区别，传统的单克隆抗体研制技术，在原封不动的运用到转基因小鼠的时候，不能达到应有的效果。因此，需要针对转基因小鼠特别优化，即多次免疫以得到高血清滴度，建立起配套的高效免疫、融合的单克隆抗体研制技术和灵敏快速的筛选、分析技术与平台。[0006]本发明解决上述技术问题的技术方案之一是:一种I3DGFRe单克隆重链抗体杂交瘤细胞的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：[0007]1制备免疫原，所述的免疫原的结构通式为:PDGFRP胞外区域-恒定区Fe;[0008]2利用所述免疫原免疫HCAb小鼠；[0009]3对所述HCAb小鼠进行1〜7次加强免疫；[0010]⑷制备所述HCAb小鼠的脾细胞悬液并与小鼠骨髓瘤细胞融合得杂交瘤细胞；[0011]5鉴定杂交瘤细胞。[0012]较佳地，步骤（1中所述恒定区Fc为人的恒定区Fe;更佳地，所述免疫原的恒定区Fe后带有His标签;进一步更佳地，所述免疫原的氨基酸序列如SwissProt数据库编号为P09619蛋白的第330-530位所示。所述免疫原的制备方法优选为将含有所述免疫原核苷酸序列的载体转染293细胞，扩增2周后取上清进行纯化；较佳地，所述载体的骨架为载体pCpC〇[0013]步骤2中所述免疫原动物的血清效价为本领域常规，较佳地为1:IO4;更佳地，所述血清效价的检测方法为间接ELISA法；[00M]步骤2中所述免疫原的剂量为本领域常规，能够达到初次免疫的目的即可，较佳地为50yg;[0015]步骤3中所述加强免疫的免疫剂量为本领域常规，能够达到免疫应答的目的即可，较佳地为25yg;[0016]步骤3中所述加强免疫的第一次与步骤2所述免疫的时间间隔优选为2周；所述加强免疫之间的时间间隔优选为3周；[0017]步骤⑶中所述加强免疫的次数为4〜6次；[0018]步骤4中所述小鼠骨髓瘤细胞为与本领域常规与脾细胞来源动物同系动物的骨髓瘤细胞，优选为小鼠骨髓瘤细胞株SP20;[0019]步骤⑷中所述脾细胞与所述骨髓瘤细胞的活细胞数目的比值优选为4:1;[0020]步骤⑸中所述鉴定包括如下步骤：[0021]a.对所得杂交瘤细胞进行离心得上清液；[0022]b.利用流式细胞仪分析上清液中抗体对PDGFRP受体阳性细胞的结合活性；[0023]c.所述流式细胞仪分析实验中平均荧光强度高于50的杂交瘤细胞为符合条件的杂交瘤细胞。[0024]本发明解决上述技术问题的技术方案之二是:一种所述制备方法制得的I3DGFRe单克隆重链抗体杂交瘤细胞。[0025]本发明解决上述技术问题的技术方案之三是：一种所述的杂交瘤细胞在制备PDGFRI3单克隆重链抗体中的应用。[0026]本发明解决上述技术问题的技术方案之四是:一种HGFRi3单克隆重链抗体的制备方法，其包括如下步骤：[0027]⑴增殖所述的杂交瘤细胞；[0028]⑵纯化步骤⑴增殖后的杂交瘤细胞得PDGFRI3单克隆重链抗体。[0029]其中，所述增殖优选为将所述的杂交瘤细胞在400〜600mL培养液中扩增2周;较佳地，所述培养液的体积为500mL。[0030]所述纯化包括如下步骤：[0031]1对所述增殖的杂交瘤细胞离心，取上清；[0032]2用ProteinA亲和层析技术进行纯化。[0033]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。[0034]本发明所用试剂和原料均市售可得。[0035]本发明的积极进步效果在于：[0036]将本发明PDGFR0抗体杂交瘤细胞及其制备方法应用于单克隆重链抗体的制备成本低、步骤简便，且该抗体能够与人PDGFRβ的胞外区相结合，并能够高效地抑制或阻断PDGFb与PDGFR0的结合，从而下调或切断相应的信号通路；其用途包括但不仅限于，抑制PDGFRP介导的信号通路并制备由PDGFRP信号通路引发的与之相关的疾病的药物等。附图说明[0037]图1为5只HCAb小鼠的血清效价。[0038]图2Α为重链抗体与免疫原结合ELISA结果；图2Β为重链抗体与带有hFc的其他非相关蛋白的ELISA结合曲线。[0039]图3为用流式细胞仪检测梯度稀释的重链抗体与过表达靶点的细胞系结合曲线。[0040]图4为蛋白免疫印迹方法检测重链抗体在人脑血管周细胞上阻断由配体PDGFb引起的磷酸化ERK水平上调。具体实施方式[0041]下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。[0042]实施例1PDGFR0抗体的制备[0043]一免疫原的制备人源PDGFRffiCD-hFc蛋白）[0044]1、免疫原结构设计[0045]PDGFRP为受体酪氨酸激酶，其胞外结构域包括5个免疫球蛋白样环。hFc是具有高度免疫原性的蛋白大分子，作为载体蛋白用于免疫原的制备，交联于其他抗原，增强化合物的免疫原性。此处设计了I3DGFRfi胞外区（ECD与人恒定区（hFc的产物，产物的C端带有His标签。编号为PDGFRffi⑶-hFc-His。具体信息见表1。[0046]表1免疫原结构信息[0047][0048]2、免疫原的表达和纯化[0049]将含有编码I3DGFRiffiCD上述表1中氨基酸序列的核苷酸序列（其中，编码人源TOGFRβ蛋白的核苷酸序列在Genebank的编号为NC_000005.10克隆到带有人IgGFc片段hFc以及6XHishFc以及His标签均通过PCR技术克隆到pCpC载体）的pCpC载体购自Invitrogen，V044-50并按已建立的标准分子生物学方法制备质粒。具体方法参见Sambrook，J.，Fritsch,E.F.,andManiatis，T·1989.MolecularCloning:ALaboratoryManual,SecondEditionPlainview1NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress〇将该质粒用瞬时转染方法感染HEK293细胞购自ATCC，美国），扩增2周后取上清上样到蛋白A亲和层析柱（IOmLMabSelectSuRe，购自GEhealthcare，货号17-5438，同时用紫外UV检测仪监测紫外吸收值A280nm的变化。上样后用PBS磷酸盐缓冲液pH7.4清洗蛋白A亲和层析柱直到紫外吸收值回到基线，然后用50mM柠檬酸钠缓冲液pH3.0洗脱，收集从蛋白A亲和层析柱上洗脱下来的带hFc的TOGFRiffiCD。用I3BS磷酸盐缓冲液pH7.4在4°C冰箱透析过夜。透析后的蛋白经0.22微米无菌过滤后分装于-80°C保存，即获得纯化的免疫原hPDGFRPECD-hFc-his。[0050]二杂交瘤细胞的制备[0051]1、免疫原免疫小鼠[0052]利用上述制备的免疫原免疫重链抗体转基因小鼠（HCAb小鼠，购自荷兰harbour公司），小鼠在SPF无特定病原体，SpecificpathogenFree条件下饲养。初次免疫时，免疫原用弗氏完全佐剂乳化后腹腔注射25μ1，即每只小鼠注射50yg免疫原。加强免疫时，免疫原用弗氏不完全佐剂乳化后腹腔注射25μ1，即每只小鼠注射50yg免疫原。初次免疫与第一次加强免疫之间间隔2周，以后每次加强免疫之间间隔3周。一般可加强免疫1〜7次，较佳地为4〜6次。[0053]2、间接ELISA法检测免疫血清效价[0054]ELISA是酶联免疫吸附性试验的简称，是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术，该技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。本发明中每次加强免疫1周后脸颊采血，用间接ELISA检测血清中免疫原的抗体效价和特异性。具体操作如下：[0055]取lygmL“一免疫原的制备”中制备得到的hPDGFRf3ECD-hFc-His溶解于磷酸盐缓冲液，包被于酶标板，IOOyL孔，4°C过夜。次日，使用I3BS缓冲液含有0.1%VVTween-20洗板三次，用0.5%明胶封闭液200yL孔，37°C封闭1小时，使用PBS缓冲液洗板三次，小鼠于第二次免疫后7天脸颊采血，鼠免疫血清用含2%新生牛血清IOmMPBS缓冲液稀释，加入酶标板，IOOyL孔37°C1小时，洗板三次后加入1:104倍稀释辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG，IOOyL孔37°C1小时，洗板后IOOyL孔加入TMB显色，室温避光20min，加50yL孔2MHCl终止反应，测450nm吸收值，以免疫前小鼠血清作为阴性对照，以测定值与对照值得比多2.1为阳性来判断免疫血清的效价。[0056]结果如图1和表2所示。图1显示所得血清效价高;表2说明，经HGFRi3胞外区免疫的小鼠的免疫后血清对免疫原均有不同程度的结合，呈现抗原抗体反应，其中最高稀释度在十万左右。其中空白对照为l%wwBSA，其中批次指第1次加强免疫后第七天的小鼠血清，表中的数据为〇D450nm值。以9396为例，血清为1:100稀释时可以和包被在ELISA板上的抗原发生很强的结合，表现为㈤值高达3.3，经过10倍稀释后㈤值逐渐降低。[0057]表2ELISA检测PDGFRP胞外区免疫后小鼠血清抗体效价[0058][0059]3、细胞融合[0060]将所选择的每只小鼠最后一次免疫腹腔注射IOOyg上述第一部分制得的PDGFRP胞外区蛋白（针对免疫原进行免疫反应的小鼠），5天后处死小鼠，收集脾细胞。加入NH4OH至终浓度1%ww，裂解脾细胞中掺杂的红细胞，获得脾细胞悬液。用DMEM基础培养基1000转每分钟离心清洗细胞3次，然后按活细胞数目4:1比率与小鼠骨髓瘤细胞SP20购自ATCC混合，采用PEG方法进行融合。[0061]4、鉴定杂交瘤细胞[0062]融合后的细胞稀释到含20%胎牛血清、IXHAT的DMEM培养基中，所述百分比为质量百分比。然后按IX105200μ1每孔加入到96孔细胞培养板中，放入5%C〇2、37°C培养箱中，所述百分比为体积百分比。14天后分别用包被抗原PDGFRP胞外区蛋白-hFc-his和hFc的ELISA微孔板蛋白检测法板筛选细胞融合板上清，将ELISA中阳性阴性比值大于10的阳性克隆扩增到24孔板，在含10%wwHT胎牛血清，DMEMinvitrogen在37°C，5%vvCO2条件下扩大培养。培养3天后取24孔板中扩大培养的培养液进行离心，收集上清液，对上清液进行抗体亚型分析，用FACS确定对PDGFR即日性细胞的结合活性结合活性的检测方法请分别参见实施例3—和实施例3二）。根据24孔板筛选结果，挑选FACS实验中MFI值50的杂交瘤细胞为符合条件的阳性克隆，选择符合条件的杂交瘤细胞用有限稀释法在96孔板进行亚克隆，在含10%^¥?85的01^]«培养基中（购自丨1^廿^61137°：，5%¥八〇2条件下培养。亚克隆后10天用ELISA进行初步筛选，挑选单个阳性单克隆扩增到24孔板继续培养。3天后用FACS确定抗原结合阳性并用PDGFRP受体配体结合实验评估生物活性评估标准为FACS实验中MFI值50。[0063]5、杂交瘤细胞扩增[0064]根据24孔板样品检测结果，挑选出最优的克隆，并于含10%wwFBS的DMEM培养基中（购自invitrogen在37°C，5%vvC〇2条件下将该最优的克隆进行扩大培养，液氮冻存即得本发明杂交瘤细胞，并可用于后续的抗体生产和纯化。[0065]实施例2抗体的生产和纯化[0066]杂交瘤细胞产生的抗体浓度较低，大约仅l-lOygmL，浓度变化较大。且培养基中细胞培养所产生的多种蛋白和培养基所含胎牛血清成分对很多生物活性分析方法都有不同程度的干扰，因此需要进行小规模l-5mg抗体生产纯化。[0067]将实施例1所得的杂交瘤细胞接种到T-75细胞培养瓶并用生产培养基Hybridomaserumfreemedium，购自Invitrogen公司）驯化传代3代。待其生长状态良好，接种细胞培养转瓶。每个2L的培养转瓶中加入500mL生产培养基，接种细胞密度为1.0XIO5AiL。盖紧瓶盖，将转瓶置于37°C培养箱中的转瓶机上，转速3转分钟。连续旋转培养14天后，收集细胞培养液，过滤去除细胞，并用〇.45μπι的滤膜过滤至培养上清液澄清。澄清的培养上清液可马上进彳T纯化或_30°C冻存。[0068]澄清的杂交瘤细胞的培养上清液300mL中的单克隆抗体用2mL蛋白A柱购自GEHealthcare纯化。蛋白A柱先用平衡缓冲液PBS磷酸缓冲液，pH7.2平衡，然后将澄清的培养上清液上样到蛋白A柱，控制流速在3mL分钟。上样完毕后用平衡缓冲液清洗蛋白A柱，平衡缓冲液的体积为4倍蛋白A柱柱床体积。用洗脱液0.IM甘氨盐酸缓冲液，pH2.5洗脱结合在蛋白G柱上的TOGFRP抗体，用紫外检测器监测洗脱情况A280紫外吸收峰）。收集洗脱的抗体，加入10%I.OMTris-HCl缓冲液中和pH，所述百分比为体积百分比，然后立即用PBS磷酸缓冲液透析过夜，第二天换液1次并继续透析3小时。收集透析后的HGFRi3抗体，用0.22μπι的滤器进行无菌过滤，无菌保存，即得纯化的重链PDGFR0抗体。[0069]将纯化的PDGFRP抗体进行蛋白浓度Α2801.4、纯度等检测分析，结果如表3所不。[0070]表3纯化的PDGFRI3抗体检测分析[0072]实施例3抗体的检定[0073]—酶联免疫吸附实验ELISA检测抗原抗体结合位点[0074]对实施例2所得的纯化的TOGFRfi抗体进行与实施例1制得的hPDGFRf3-hFc_his蛋白分别进行结合反应。[0075]将实施例1获得的纯化的免疫原用I3BS稀释到终浓度5.0ygmL，然后以ΙΟΟμΙ每孔加到96孔ELISA板。用塑料膜封好4°C孵育过夜，第二天用洗板液[PBS+0.01%ννTween20]洗板2次，加入封闭液[PBS+0·01%vvTween20+1%wwBSA]室温封闭2小时。倒掉封闭液，加入实施例2所得的纯化的roGFRP抗体1ΟΟμ1每孔。37°C孵育2小时后，用洗板液[PBS+0.01%vvTween20]洗板3次。加入HRP辣根过氧化物酶）标记的二抗（购自Sigma，37°C孵育2小时后，用洗板液[PBS+0.01%vvTWeen20]洗板3次。加入TMB底物100μΐ每孔，室温孵育30分钟后，加入终止液（I.ONHC1ΙΟΟμΙ每孔。用ELISA读板机SpectraMax384pIus，购自MolecularDevice读取A450nm数值，结果如图2和表4所不，其中IgG对照为小鼠IgG，表中的数据为0D450nm值。表4和图2的结果说明：ELISA包板抗原，IOOnM本发明重链抗体作为起始浓度进行1:10梯度稀释，表4中即为反应后的㈤值，即图2A;由于免疫原上有hFc标签蛋白，图2B中ELISA板包被了其他带了hFc的蛋白，这些抗体并没有与它们发生抗原抗体反应，说明了这个重链抗体特异性地与抗原结合而不是与标签蛋白结合。[0076]表4ELISA检测PDGFR0抗体与PDGFR0胞外结构域的结合[0078]二流式细胞实验FACS检测抗体与PDGFRP表达细胞的结合[0079]将含有编码人源PDGFRP全长氨基酸详见UniprotP09619序列的核苷酸序列（详见GenebankID:NC_000005.10导入HEK293细胞株得含人I3DGFRP的HEK293稳定细胞株此处称为HEK293-hroGFRi3稳定细胞株），然后在T-75细胞培养瓶中扩大培养至90%汇合度，吸尽培养基，用PBS缓冲液Phosphatebuffersaline购自Invitrogen洗涤2次，然后用无酶细胞解离液Versenesolution:购自Lifetechnology公司）处理和收集细胞。用PBS缓冲液洗涤细胞2次，进行细胞计数后将细胞用PBS缓冲液稀释至2XIO6细胞mL，加入2%小牛血清封闭液，所述百分比为质量百分比，室温孵育15分钟，然后用PBS缓冲液离心洗涤2次。将收集的细胞用FACS缓冲液PBS+2%FBS，所述百分比为质量百分比）悬浮至3XIO6细胞mL，按每孔ΙΟΟμΙ加入到96孔FACS反应板中，加入实施例2所得的纯化的TOGFRfi抗体待测样品每孔1〇〇μ1，4°C孵育1小时。用FACS缓冲液离心洗涤2次，[0080]加入每孔ΙΟΟμΙ荧光Alexa488标记的二抗购自Invitrogen，4°C孵育1小时。用FACS缓冲液离心洗涤3次，加入每孔ΙΟΟμΙ固定液[4%vv多聚甲醛]悬浮细胞，10分钟后用FACS缓冲液离心洗涤2次。用IOOylFACS缓冲液悬浮细胞，用FACSFACSCalibur，购自BD公司）检测和分析结果。结果如图3和表5所示，表5说明，待测抗体可结合细胞表面的PDGFR0。其中IgG对照为鼠IgGmlgG，表中的数据为所测细胞群的平均荧光强度值MFI。图3说明，用梯度稀释的抗体孵育细胞，并用alxa-488标记的二抗（购自Lifetechnologies进行再次孵育，可以测量到39E10E12B3与过表达PDGFRI3的细胞系有良好的结合，而阴性对照mlgG没有得到荧光信号。[0081]表5FACS检测PDGFR0抗体与HEK293-hPDGF肋的结合反应[0082][0083]实施例4蛋白印迹法实验检测PDGFRI3抗体阻断PDGFb引起的PDGFRI3介导的下游信号通路[0084]对于用蛋白印迹法分析，用裂解缓冲液（1%wvSDS，lmMTrispH7.4，2mM钒酸钠，2mMEGTA，2mMEDTA，ImM苯甲基磺酰氟和mM氟化钠处理HBVP人脑血管周细胞来获得溶解物，并将溶解物煮沸，在4°C以IOOOOg离心5分钟，去除不可溶沉淀。将上清液与SDS样本缓冲液混合，煮沸10分钟。根据本领域广泛运用的方法进行SDS-PAGE和蛋白印迹法，使用的样本如下：12%303-聚丙烯酰胺胶，？¥0?膜1^11丨？〇代#1?¥!100010，美国），用作用于磷酸化ERK的第一抗体的抗磷酸化ERKCellSignalingtechnology,美国）和抗ERK抗体CellSignalingtechnology,美国）；和用作第二抗体的HRP偶联的羊抗鼠IgG抗体SantaCruzeBltechnology,美国）。见图4。图4说明：重链抗体39E10E12B3可以阻断由I3DGFb引起的HBVP内ERK的磷酸化，而pERK磷酸化是多种细胞功能指标，如增殖。[0085]实施例5重链可变区氨基酸序列测定[0086]总RNA分离:将实施例1二第5步骤的杂交瘤细胞的扩增中亚克隆培养所得的上清液检验过抗原结合后（即经过实施例3〜5的检定和活性测定后），通过离心搜集5XIO7个杂交瘤细胞，加入ImLTrizol混匀并转移到1.5mL离心管中，室温静置5分钟；加0.2mL氯仿，振荡15秒，静置2分钟后于4°C，12000g离心5分钟，取上清转移到新的1.5mL离心管中；加入0.5mL异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10分钟后于4°C，12000g离心15分钟，弃上清；加入ImL75%乙醇所述百分比为体积百分比），轻轻洗涤沉淀，4°C，12000g离心5分钟后弃上清，将沉淀物晾干，加入DEPC处理过的H2O溶解55°C水浴促进溶剂10分钟），即得总RNA。[0087]逆转录与PCR:取Iyg总RNA，配置20μ1体系，加入逆转录酶后于42°C反应60分钟，于7°C反应10分钟终止反应。配置50ylPCR体系，包括lylcDNA、每种引物25ρπιο1、1μ1DNA聚合酶以及相配的缓冲体系、250ymoIdNTPs;设置PCR程序，预变性95°C3分钟，变性95°C30秒，退火55°C30秒，延伸72°C35秒，35个循环后再额外于72°C延伸5分钟，得PCR产物。其中逆转录所用的试剂盒为PrimeScriptRTMasterMix，购自Takara，货号RR036;PCR所用的试剂盒包括Q5超保真酶，购自NEB，货号M0492。[0088]克隆与测序:取5μ1PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将检测阳性样品使用柱回收试剂盒纯化，其中回收试剂盒为购自MACHEREY-NAGEL，货号740609。进行连接反应:样品50ng，T载体50ng，连接酶0.5μ1，缓冲液Ιμΐ，反应体系10μ1，于16°C反应半小时得连接产物，其中连接的试剂盒为T4DNA连接酶，购自NEB，货号M0402;取5μ1连接产物加入ΙΟΟμΙ的感受态细胞（EcosIOlcompetentcells,购自Yeastern，货号FYE607中，冰浴5分钟，而后于42°C水浴热激1分钟，放回冰上1分钟后加入650μ1无抗生素SOC培养基，于37°C摇床上以200RPM的速度复苏30分钟，取出200μ1涂布于含抗生素的LB固体培养基上于37°C孵箱过夜培养;次日，使用T载体购自Takara，货号6011上引物M13F核苷酸序列:GTAAAACGACGGCCAGT和M13R核苷酸序列：CAGGAAACAGCTATGAC配置30μ1PCR体系，进行菌落PCR，用移液器枪头蘸取菌落于PCR反应体系中吹吸，并吸出〇.5μ1点于另一块含IOOnM氨苄青霉素的LB固体培养皿上以保存菌株;PCR反应结束后，取出5μ1进行琼脂糖凝胶电泳检测，将阳性样品进行测序和分析[参见Kabat，“SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,’’NationalInstitutesofHealth,Bethesda，Md.1991]。测序结果如表6〜7所示。[0089]表6PDGFRP抗体蛋白氨基酸序列编号[0090][0091]表7PDGFR0抗体基因（DNA序列编号[0093]其中，表6和7中的数字即为序列表中序列号，如39E10E12B3的重链蛋白可变区的氨基酸序列为SEQIDNo.1，39E10E12B3的重链蛋白可变区中⑶Rl的氨基酸序列为SEQIDNo.2，CDR2的氨基酸序列为SEQIDNo.3，CDR3的氨基酸序列为SEQIDNo.4;编码39E10E12B3的重链蛋白可变区的核苷酸序列为SEQIDNo.5。[0094]其中，编码39E10E12B3的重链蛋白可变区中⑶Rl的核苷酸序列为序列表SEQIDNo.5中的第76位至第99位；[0095]编码39E10E12B3的重链蛋白可变区中CDR2的核苷酸序列为序列表SEQIDNo.5中的第151位至第174位；[0096]编码39E10E12B3的重链蛋白可变区中⑶R3的核苷酸序列为序列表SEQIDNo.5中的第289位至第312位。[0097]应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

权利要求：1.一种PDGFRP单克隆重链抗体杂交瘤细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：⑴制备免疫原，所述的免疫原的结构通式为:PDGFRP胞外区域-恒定区Fe;⑵利用所述免疫原免疫HCAb小鼠；⑶对所述HCAb小鼠进行1〜7次加强免疫；⑷制备所述HCAb小鼠的脾细胞悬液并与小鼠骨髓瘤细胞融合得杂交瘤细胞；⑸鉴定杂交瘤细胞。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1中所述恒定区Fe为人的恒定区Fe;较佳地，所述免疫原的恒定区Fe后带有His标签。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述PDGFR0胞外区域的氨基酸序列如SwissProt数据库编号为P09619蛋白的第330-530位所示。4.如权利要求3所述的制备方法，较佳地，所述免疫原的制备方法包括将含有免疫原的载体转染293细胞，扩增2周后取上清进行纯化;较佳地，所述载体的骨架为载体pCpC。5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中所述免疫原动物的血清效价为1:IO4;较佳地，所述血清效价的检测方法为间接ELISA法；步骤⑵中所述免疫原的剂量为50yg;步骤⑶中所述加强免疫的免疫剂量为25yg;步骤3中所述加强免疫的第一次与步骤2所述免疫的时间间隔为2周；所述加强免疫之间的时间间隔为3周；步骤⑶中所述加强免疫的次数为4〜6次；步骤⑷中所述小鼠骨髓瘤细胞为小鼠骨髓瘤细胞株SP20;步骤⑷中所述脾细胞与所述骨髓瘤细胞的活细胞数目的比值为4:1;和或，步骤⑸中所述鉴定包括如下步骤：a.对所得杂交瘤细胞进行离心得上清液；b.利用流式细胞仪分析上清液中抗体对PDGFRP受体阳性细胞的结合活性；c.所述流式细胞仪分析实验中平均荧光强度高于50的杂交瘤细胞为符合条件的杂交瘤细胞。6.—种如权利要求1〜5任一项所述的制备方法制得的PDGFRI3单克隆重链抗体杂交瘤细胞。7.—种如权利要求6所述的杂交瘤细胞在制备PDGFRP单克隆重链抗体中的应用。8.—种PDGFRfi单克隆重链抗体的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：1增殖如权利要求6所述的杂交瘤细胞；⑵纯化步骤⑴增殖后的杂交瘤细胞得PDGFRfi单克隆重链抗体。9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述增殖为将权利要求6所述的杂交瘤细胞在400〜600mL培养液中扩增2周;较佳地，所述培养液的体积为500mL。10.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述纯化包括如下步骤：1对所述增殖的杂交瘤细胞离心，取上清；⑵用ProteinA亲和层析技术进行纯化。

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