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申请/专利权人：沈阳农业大学

摘要：一种提高东方百合‘西伯利亚’遗传转化效率的方法，属于花卉生物技术领域。该方法对‘西伯利亚’百合遗传转化体系进行了优化。针对‘西伯利亚’百合愈伤组织培养过程中，严重褐化、极易分化不定芽、失去胚性状态的现象，利用变温处理，在保证胚性的基础上，将愈伤组织的继代周期延长至33天以上，为遗传转化提供了稳定、持久的受体材料，大幅度降低转化工作量。在农杆菌侵染和共培养步骤，使用‘羟敌草腈’替代传统的乙酰丁香酮为活化剂，诱导农杆菌Vir区基因表达，使得转化效率提高二倍以上。优化后的遗传转化体系，可用于东方百合的分子遗传改良、种质资源创制、基因工程育种以及百合发育和繁殖等领域的基因功能验证。

主权项：1.一种提高东方百合‘西伯利亚’遗传转化效率的方法，其特征在于，包括以下工艺步骤：步骤1，胚性愈伤组织的诱导和保存将旺盛生长阶段的百合组培苗的小鳞片切成0.5cm2大小，接种在培养基MS+2.0mgLPIC+30gL蔗糖+7gL琼脂中暗培养，培养温度为25±1℃，相对湿度为80-90%，直至形成黄绿色颗粒状明显的愈伤组织；33天转接一次，每次转接时，将愈伤组织与外植体分离并切去褐化部分，在20℃完全黑暗条件下培养；步骤2，农杆菌侵染液的制备挑取携带植物表达载体的农杆菌EHA105单菌落，接种于包含50mgLKan和50mg·L-1Rif的YEB液体培养基中振荡培养至OD600为0.6，5000rpm离心10min，收集菌体；取50mL含3μMCX的MS液体培养基重悬菌体后，200rpm重悬液振荡2h，即为侵染液；步骤3，农杆菌侵染和共培养切取淡黄色在25℃条件下培养10-15天的体细胞胚，扎孔造伤后投入农杆菌侵染液中；轻轻晃动培养瓶使愈伤组织与侵染液充分接触10min后取出，迅速吸干组织块表面的残留菌液，转移至共培养培养基MS+2.0mgLPIC+3μMCX+30gL蔗糖+7gL琼脂中暗培养，培养温度为20±1℃；步骤4，抗性愈伤组织的筛选共培养48h后，将愈伤组织转移至MS+2.0mgLPIC+400mgLCef+150mgLKan+30gL蔗糖+7gL琼脂培养基中筛选脱菌2周后，转接到相同培养基中继续筛选脱菌培养15d转接一次；每次转接均切除愈伤组织块的褐化部分；步骤5，抗性愈伤组织再生抗性筛选8周以上，愈伤组织褐化、坏死现象逐渐减轻；将健康的黄色抗性愈伤组织转入萌发培养基MS+0.5mgL6-BA+0.88gLCaCl2+30gL蔗糖+7gL琼脂培养基中，光下培养，每天16h光照8h黑暗，光照强度36μmol·m-2·s-1，培养温度为25±1℃；6周后，愈伤组织经体细胞胚发生途径再生成为完整的转化植株;所述步骤2和步骤3在侵染液和共培养培养基中，添加3μM羟敌草腈用于提高‘西伯利亚’百合体细胞胚的分化。

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