申请/专利权人：青海省农林科学院;青海大学

申请日：2023-09-26

公开（公告）日：2023-12-08

公开（公告）号：CN117187358A

主分类号：C12Q1/6858

分类号：C12Q1/6858;C12Q1/6895;C12N15/11

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2023.12.26#实质审查的生效;2023.12.08#公开

摘要：本发明公开了一种黑果枸杞和宁夏枸杞杂交种的鉴定方法，通过对设计若干对微卫星引物进行筛选，包括数量相同的黑果枸杞引物、黄果枸杞引物及宁夏枸杞引物，然后再分别选择黑果枸杞、杂交带枸杞和宁夏枸杞若干个DNA样品对选取的引物进行PCR扩增，基于SSR进行黑果枸杞与宁夏枸杞杂交种进行检测，再进行纯种和杂交种的鉴定以及种群数目K值的判断，最后获取杂交情况。如此利用了SSR标记具有共显性的特点，大多数情况下微卫星在生物的基因组中分布，变异位点中包含很多遗传基因，从而在鉴定宁夏枸杞和黑果枸杞杂交种的SSR标记的开发和应用中，达到多态性稳定且重复率高、操作便利、灵敏度好等效果。

主权项：1.一种黑果枸杞和宁夏枸杞杂交种的鉴定方法，其特征在于：按以下步骤进行：1、SSR数据的获得和引物的设计：设计若干对微卫星引物进行筛选，包括数量相同的黑果枸杞引物、黄果枸杞引物及宁夏枸杞引物，然后再分别选择黑果枸杞、杂交带枸杞和宁夏枸杞若干个DNA样品对选取的引物进行PCR扩增；通过对引物长度、产物长度以及Tm值的额对比分析，对引物进行合成；2、引物的验证：2.1、叶片DNA提取通过改进的CTAB法提取和纯化枸杞叶片基因组DNA，用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性；2.2、扩增体系构建根据紫外光谱分析法，紫外分光光度计测定DNA模板的浓度和质量，用时将模板浓度稀释至20-40ngμL；经测定，模板浓度约为100ngμL，A260A280为1.7-2.0，以满足SSR对模板质量的要求；经过对复性温度和延伸温度与时间的梯度PCR，确定最终的SSR-PCR反应程序：195℃预变性5min；294℃变性30s；354℃退火45s；472℃延伸1min；5步骤2-4共循环40次；672℃延伸7min；74℃保存；选取合成的引物以及DNA模板进行体系筛选；2.3、引物筛选利用选择的PCR体系对生物合成的引物进行筛选，进而对若干若干个单株样本进行扩增；选择模板DNA对所有引物进行筛选，最终得到若干对特异性良好的引物；3、基于SSR进行黑果枸杞与宁夏枸杞杂交种的检测：将筛选出的引物分别用若干个模板DNA进行SSR分子标记，记录扩增后的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果；4、利用软件STRUCTURE2.3进行纯种和杂交种的鉴定分析时不作数迭代设置为10000,不作数迭代后的MCMC设置为100000；设定不同的划分群体数目，即K值，为确定合适的类群数目，K取值从2到8，X是基因型，对多为点基因型数据进行对数运算，即lnPX|K，用来确定K值；每一K值下运算若干次，用于计算ΔK，ΔK的计算是基于相邻K值的lnPX|K的差值,即ΔK＝m|LK+1-2LK+LK|s|LK|，依据lnPX|K和ΔK的值确定合适的K值；在混合模型中，根据后验概率估算每一样品的基因来源及其比例，根据混合系数Q来判定纯合体和杂合体，Q的阈值为0.9；5、种群数目K值的判断在不输入任何物种信息的条件下，利用软件STRUCTURE2.3.1对各样品的SSR数据进行遗传结构及模型聚类分析；对ΔK进行计算，峰值在K＝3时出现，ΔK＝1.977，且远大于K＝5时的值0.731，而K＞3时，ΔK的值更小，均小于1；6、获取杂交情况根据STRUCTURE软件的输出结果，以纵坐标为Q值，横坐标为个体，Q≥0.9的个体为纯合子，Q＜0.9的个体为杂种；K＝3时共分为3个群体，黑果枸杞和宁夏枸杞，且两个亲本黑果枸杞和宁夏枸杞都有其他基因的存在。

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权利要求：

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