申请/专利权人：广东一方制药有限公司

申请日：2022-07-13

公开（公告）日：2024-06-04

公开（公告）号：CN116448896B

主分类号：G01N30/02

分类号：G01N30/02;G01N30/06;G01N30/72

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.06.04#授权;2023.08.04#实质审查的生效;2023.07.18#公开

摘要：本发明提供了一种五灵脂标准汤剂的化学成分的分离方法，包括如下步骤：获取五灵脂标准汤剂的提取物；将提取物进行第一次反相层析、第二次反相层析、第三次反相层析、第一次凝胶层析、第四次反相层析与第五次反相层析；将Fr.A1‑3‑7进行第一次半制备高效液相色谱分离，制备化合物1；将Fr.A1‑3‑11进行第二次半制备高效液相色谱分离，制备化合物2与化合物3；将Fr.A1‑4‑2进行第三次半制备高效液相色谱分离，制备化合物4与化合物5；将Fr.A1‑4‑4进行第二次凝胶层析，采用甲醇洗脱，制备化合物6；将Fr.A2‑3进行第四次半制备高效液相色谱分离，制备化合物7。

主权项：1.一种五灵脂标准汤剂的化学成分的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：获取五灵脂标准汤剂的提取物；所述五灵脂标准汤剂的提取物的制备包括如下步骤：将所述五灵脂标准汤剂的冻干粉，与质量分数为60%~80%的甲醇混合，超声，然后过滤，取滤液，浓缩；将所述提取物进行第一次ODS柱层析，第一次分段收集流分，制备流分Fr.A、Fr.B与Fr.C；其中，第一次ODS柱层析的条件包括：洗脱液为甲醇与水，采用梯度洗脱，甲醇的体积百分数从40%变化至100%；第一次ODS柱层析中，洗脱液为体积百分数为40%的甲醇水溶液，收集流分，制备流分Fr.A；和洗脱液为体积百分数为70%的甲醇水溶液，收集流分，制备流分Fr.B；和洗脱液为体积百分数为95%的甲醇水溶液，收集流分，制备流分Fr.C；将Fr.A进行第二次ODS柱层析，第二次分段收集流分，制备子流分Fr.A1、Fr.A2、Fr.A3与Fr.A4；其中，第二次ODS柱层析的条件包括：洗脱液为甲醇与水，采用梯度洗脱，甲醇的体积百分数从0%变化至50%；第二次ODS柱层析中，洗脱液为水，收集流分，制备流分Fr.A1；和洗脱液为体积百分数为10%的甲醇水溶液，收集流分，制备流分Fr.A2；和洗脱液为体积百分数为30%的甲醇水溶液，收集流分，制备流分Fr.A3；和洗脱液为体积百分数为50%的甲醇水溶液，收集流分，制备流分Fr.A4；将Fr.A1进行第三次ODS柱层析，第三次分段收集流分，制备子流分Fr.A1-1、Fr.A1-2、Fr.A1-3与Fr.A1-4；其中，第三次ODS柱层析的条件包括：洗脱液为乙腈与质量分数为0.1%的甲酸溶液，采用梯度洗脱，乙腈的体积百分数从3%变化至20%；第三次分段收集流分后还包括如下步骤：采用第一次高效液相色谱分析，合并相同流分，制备子流分Fr.A1-1、Fr.A1-2、Fr.A1-3与Fr.A1-4；其中，第一次高效液相色谱分析的条件包括：流动相A为乙腈，流动相B为质量分数为0.1%的磷酸溶液；采用梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序为：0min~28min，流动相A的体积百分数从5%变化至15%；28min~50min，流动相A的体积百分数由15%变化至20%；50min~58min，流动相A的体积百分数保持为20%；58min~63min，流动相A的体积百分数由20%变化至38%；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；柱温为25℃~35℃；流速为0.5mLmin~1.5mLmin；检测波长为260nm~280nm；将Fr.A1-3进行第一次凝胶层析，第四次分段收集流分，制备子流分Fr.A1-3-1、Fr.A1-3-2、Fr.A1-3-3、Fr.A1-3-4、Fr.A1-3-5、Fr.A1-3-6、Fr.A1-3-7、Fr.A1-3-8、Fr.A1-3-9、Fr.A1-3-10、Fr.A1-3-11、Fr.A1-3-12与Fr.A1-3-13；其中，第一次凝胶层析的条件包括：凝胶柱为SephadexLH-20凝胶柱，洗脱液为甲醇与水，采用等度洗脱，甲醇的体积百分数为65%~75%；第四次分段收集流分后还包括如下步骤：采用第二次高效液相色谱分析，合并相同流分，制备子流分Fr.A1-3-1、Fr.A1-3-2、Fr.A1-3-3、Fr.A1-3-4、Fr.A1-3-5、Fr.A1-3-6、Fr.A1-3-7、Fr.A1-3-8、Fr.A1-3-9、Fr.A1-3-10、Fr.A1-3-11、Fr.A1-3-12与Fr.A1-3-13；其中，第二次高效液相色谱分析的条件包括：流动相A为乙腈，流动相B为质量分数为0.1%的磷酸溶液；采用梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序为：0min~28min，流动相A的体积百分数从5%变化至15%；28min~50min，流动相A的体积百分数由15%变化至20%；50min~58min，流动相A的体积百分数保持为20%；58min~63min，流动相A的体积百分数由20%变化至38%；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；柱温为25℃~35℃；流速为0.5mLmin~1.5mLmin；检测波长为260nm~280nm；将Fr.A1-4进行第四次ODS柱层析，第五次分段收集流分，制备子流分Fr.A1-4-1、Fr.A1-4-2、Fr.A1-4-3、Fr.A1-4-4与Fr.A1-4-5；其中，第四次ODS柱层析的条件包括：洗脱液为乙腈与质量分数为0.08%~0.12%的甲酸溶液，采用梯度洗脱，乙腈的体积百分数从3%变化至50%；第五次分段收集流分后还包括如下步骤：采用第三次高效液相色谱分析，合并相同流分，制备子流分Fr.A1-4-1、Fr.A1-4-2、Fr.A1-4-3、Fr.A1-4-4与Fr.A1-4-5；其中，第三次高效液相色谱分析的条件包括：流动相A为乙腈，流动相B为质量分数为0.1%的磷酸溶液；采用梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序为：0min~28min，流动相A的体积百分数从5%变化至15%；28min~50min，流动相A的体积百分数由15%变化至20%；50min~58min，流动相A的体积百分数保持为20%；58min~63min，流动相A的体积百分数由20%变化至38%；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；柱温为25℃~35℃；流速为0.5mLmin~1.5mLmin；检测波长为260nm~280nm；将Fr.A2进行第五次ODS柱层析，第六次分段收集流分，制备子流分Fr.A2-1、Fr.A2-2、Fr.A2-3、Fr.A2-4与Fr.A2-5；其中，第五次ODS柱层析的条件包括：洗脱液为乙腈与水，采用梯度洗脱，乙腈的体积百分数从5%变化至70%；第六次分段收集流分后还包括如下步骤：采用第四次高效液相色谱分析，合并相同流分，制备子流分Fr.A2-1、Fr.A2-2、Fr.A2-3、Fr.A2-4与Fr.A2-5；其中，第四次高效液相色谱分析的条件包括：流动相A为乙腈，流动相B为质量分数为0.1%的磷酸溶液；采用梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序为：0min~28min，流动相A的体积百分数从5%变化至15%；28min~50min，流动相A的体积百分数由15%变化至20%；50min~58min，流动相A的体积百分数保持为20%；58min~63min，流动相A的体积百分数由20%变化至38%；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；柱温为25℃~35℃；流速为0.5mLmin~1.5mLmin；检测波长为260nm~280nm；将Fr.A1-3-7进行第一次半制备高效液相色谱分离，制备化合物1；将Fr.A1-3-11进行第二次半制备高效液相色谱分离，制备化合物2与化合物3；将Fr.A1-4-2进行第三次半制备高效液相色谱分离，制备化合物4与化合物5；将Fr.A1-4-4进行第二次凝胶层析，采用甲醇洗脱，制备化合物6；将Fr.A2-3进行第四次半制备高效液相色谱分离，制备化合物7。

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百度查询： 广东一方制药有限公司 五灵脂标准汤剂的化学成分的分离方法与结构鉴定方法

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