申请/专利权人：福安药业集团烟台只楚药业有限公司

申请日：2023-07-31

公开（公告）日：2024-06-14

公开（公告）号：CN118185918A

主分类号：C12N13/00

分类号：C12N13/00;C12N15/01;C12Q1/04;G01N21/31;G01N30/02;C12R1/29

优先权：

专利状态码：在审-公开

法律状态：2024.06.14#公开

摘要：本发明公开了一种绛红色小单孢菌原生质体ARTP诱变及融合筛选高产菌株的方法，其方法包括如下步骤：a、孢子菌获取，b、原生质体悬液制备，c、对原生质体进行ARTP诱变处理，d、融合子制备，e、单菌落制备，f、单菌落挑选和培养，g、菌落由种孔板接孔发酵孔板和斜面孔板，h、发酵孔板培养3d，对发酵液处理，酶标仪检测；i、斜面孔板培养10d，再传茄瓶斜面，并对茄瓶斜面孢子进行一级和二级摇瓶考察；本发明的方法，对原生质体ARTP诱变处理，更易于基因改变，单一方法诱变与融合结合进行优化，提高了优良菌株的选育进程，并对其生长特性的跟踪观察，经过多次的考察筛选，筛选出高性能菌株，提高庆大霉素的产量。

主权项：1.一种绛红色小单孢菌原生质体ARTP诱变及融合筛选高产菌株的方法，其特征在于，所述方法如下：a、孢子菌获取，取一支生长丰满并培养成熟的孢子斜面，挖取1cm2的孢子块接种至种瓶培养基中，培养2d，获取生长对数期菌悬液；b、原生质体悬液制备，将上一步获取的生长对数期菌悬液在离心机中采用3000rmin离心15min得到菌体，加P稳定液洗涤3~5次并除去杂质，加入终浓度为2.5mgml的溶菌酶进行酶解90~120min，此过程前三次间隔20min镜检一次，接着每隔10min镜检一次，镜检取样采用压滴法制片进行镜检原生质体形成情况，当镜检超过80~90%菌体脱去细胞壁，呈现单一的原生质体球时，停止酶解反应，用装有脱脂棉的过滤装置过滤，滤液转在离心管中，并在1500rmin条件下离心15min，加P稳定液洗涤3~5次，得到原生质体悬液；c、对原生质体进行ARTP诱变处理，将上一步得到的原生质体悬液用移液枪吸取20μl原生质体悬液置于ARTP诱变样品器中进行诱变，调节诱变参数为诱变高度2mm、气体流量12slm，诱变时间设置为40s，完成诱变；d、融合子制备，将上一步得到的原生质体悬液计算原生质体浓度，每毫升原生质体数=[（A1+A2+A3+A4+A5）80]×4000000×稀释倍数，按照1:1混合，1500rmin离心15min，弃上清，加入融合剂40%PEG40002ml，融合30min，此过程经过轻混和镜检，原生质体融合结束，融合结束加P稳定液洗涤3~5次，1500rmin，离心15min，得到融合子；e、单菌落制备，将上一步得到的融合子用P稳定液按照正常分离逐步稀释10-3、10-4、10-5和10-6，分别取100μl融合子涂在分离固体培养基的平板上，在条件为35.5±1℃和湿度45~65%下培养10~12d，得到单菌落；f、单菌落挑选和培养，将上一步得到的单菌落，通过目视挑选单菌落，用灭菌的牙签挑取单菌落，接种于24孔的种孔板培养基中，在条件为35.5±1℃、220rmin条件下，培养42h；g、菌落由种孔板接孔发酵孔板和斜面孔板，从上一步的种孔板吸取600μl接于24孔发酵孔板中，35.5±1℃、220rmin，培养3~4d；再吸取100μl接于斜面孔板中，35.5±1℃、湿度45-65%下培养10d；h、发酵孔板培养，经过上一步的发酵孔板培养完成后，使用20%硫酸酸化发酵液至pH1.5~2.0，混合后静置20min，3000rmin，离心20min，再吸取20μl酸化后的发酵液置于96孔板中，加入160μl的OPA衍生试剂、820μl的ddH2O，并在60℃水浴15min，之后吸取200μl衍生后的发酵液加入96孔板中，其中，96孔板外沿一圈不加检测样品，加ddH2O代替样品，酶标仪检测吸光度，震荡5s，设置检测波长为325nm；i、斜面孔板培养，经过酶标仪检测筛选得到数据较高的菌株，从斜面孔板传茄瓶斜面，在35.5±1℃、湿度45-65%下培养10d；挖取1.0cm2孢子接入种子瓶中，35.5℃±1，220rmin下培养42h，在超净工作台中吸取10ml菌丝种子，接入发酵摇瓶，35.5±1℃，220rmin，培养96h；j、对茄瓶斜面孢子进行一级和二级摇瓶考察，将上一步发酵摇瓶中的发酵液酸化至pH1.5~2.0，混匀静置20min，过滤取上清液，衍生化步骤与发酵孔板培养步骤一致，并采用高效液相色谱仪检测效价及组份；液相条件：色谱柱为AgilentZorbaxSB-C18，柱温为30℃，流动相为甲醇：水相：乙酸=710:240:50（VVV），流速1.5mlmin，检测波长为330nm；对筛选出来的高产菌株连续传代培养，在超净工作台里用2#棒轻刮取孢子，接种于3支空白斜面培养基中，并在35.5±1℃和湿度45-65%条件下培养10d，培养成熟后，挖取1.0cm2孢子接入种子瓶中，培养42h，接发酵摇瓶，培养条件与斜面孔板培养步骤一致，使用高效液相色谱的方法检测发酵液效价和各组份，重复上述工作4次。

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