申请/专利权人：中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所(国家热带病研究中心)

申请日：2020-06-24

公开（公告）日：2024-06-21

公开（公告）号：CN113832234B

主分类号：C12Q1/6888

分类号：C12Q1/6888;C12Q1/6851;C12N15/113

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.06.21#授权;2022.01.11#实质审查的生效;2021.12.24#公开

摘要：本发明公开了一种细粒棘球绦虫原头节源和囊液源外泌体非编码RNA表达谱分析方法，包括如下步骤：1细粒棘球绦虫原头节和囊液分离；2细粒棘球绦虫原头节体外培养；3细粒棘球绦虫原头节和囊液源外泌体分离，获得原头节源外泌体PSC‑ELVs和囊液源外泌体HF‑ELVs；4透射电镜分析；5纳米粒径跟踪分析；6Westernblotting；7miRNA文库构建及测序；8全转录组测序文库构建及测序分析；9ceRNA调控网络构建。此外，本发明还公开了采用该方法筛选获得的细粒棘球绦虫原头节源和囊液源外泌体非编码RNA。本发明为国际上首次获得细粒棘球蚴原头节源和囊液源外泌体中非编码RNA表达谱。

主权项：1.一种细粒棘球绦虫原头节源和囊液源外泌体非编码RNA表达谱分析方法，其特征在于，包括如下步骤：1细粒棘球绦虫原头节和囊液分离；2细粒棘球绦虫原头节体外培养；3细粒棘球绦虫原头节和囊液源外泌体分离，获得原头节源外泌体PSC-ELVs和囊液源外泌体HF-ELVs；4透射电镜分析；5纳米粒径跟踪分析；6Westernblotting；7miRNA文库构建及测序；8全转录组测序文库构建及测序分析；9ceRNA调控网络构建；步骤2具体为：将步骤1分离的原头节重悬于RPMI1640完全培养基中，接种于T75的细胞培养瓶中，加入抗生素和葡萄糖置于37℃，5％CO2培养箱；每12h收集一次原头节培养上清并更换新的培养基，并吸取部分原头节悬液，用1％台盼蓝染色计数判断其活性；将原头节在无血清培养基中培养7d，收集培养上清，-80℃保存；步骤3具体为：将收集的原头节培养上清和囊液分别置于离心管内，依次离心，去除大的死细胞和细胞碎片，过滤上清液；将过滤后的原头节培养上清和囊液，超速离心；沉淀用PBS洗涤，并以相同的速度进一步超离心纯化；最后将获得的原头节源外泌体PSC-ELVs和囊液源外泌体HF-ELVs分别重悬于PBS中，并保存在-80℃下直至使用；步骤6具体为：将ELV沉淀与5×SDS和1×PBS混合，100℃煮沸；取蛋白质样品在10％SDS-PAGE凝胶上分离，然后将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯膜；含5％牛血清白蛋白的TBS-0.05％Tween20中封闭1h，将膜与以下兔多克隆抗体：抗14-3-3zetadelta，抗烯醇酶和抗CD9抗体，4℃过夜；然后用HRP偶联的山羊抗兔抗体，1：5000，室温孵育30min；ECL蛋白质印迹检测系统对膜进行可视化检测。

全文数据：

权利要求：

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