申请/专利权人：细胞生态海河实验室;中国医学科学院血液病医院(中国医学科学院血液学研究所)

申请日：2024-04-29

公开（公告）日：2024-06-28

公开（公告）号：CN118109512B

主分类号：C12N15/85

分类号：C12N15/85;C12N15/12;A01K67/0276

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.06.28#授权;2024.06.18#实质审查的生效;2024.05.31#公开

摘要：本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及tpi1a基因缺失斑马鱼突变体的制备方法及磷酸丙糖异构酶缺乏症斑马鱼疾病模型的构建方法，上述tpi1a基因缺失斑马鱼突变体的制备方法中tpi1a基因利用CRISPRCas9基因编辑技术敲除，本发明利用CRISPRCas9技术首次实现在斑马鱼中特异性敲除tpi1a基因，获得可以稳定遗传的tpi1a基因缺失突变体。上述磷酸丙糖异构酶缺乏症斑马鱼疾病模型的构建方法，包括以下步骤：S100、制备斑马鱼tpi1a基因缺失突变体；S200、针对斑马鱼tpi1b基因的吗啉代寡核苷酸注射至一细胞期所述斑马鱼tpi1a基因缺失突变体胚胎中，得到磷酸丙糖异构酶缺乏症斑马鱼疾病模型，构建得到的磷酸丙糖异构酶缺乏症疾病模型不仅可用于疾病的分子机制研究，亦可以用于高通量药物筛选。

主权项：1.一种斑马鱼tpi1a基因缺失突变体的制备方法，其特征在于，所述tpi1a基因利用CRISPRCas9基因编辑技术敲除，鉴定敲除tpi1a基因使用的上游引物为tpi1a-target1-F，所述tpi1a-target1-F的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；鉴定敲除tpi1a基因使用的下游引物为tpi1a-target1-R，所述tpi1a-target1-R的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，包括如下步骤：S1、将敲除斑马鱼tpi1a基因的靶位点gRNA和Cas9蛋白共同注射到野生型斑马鱼一细胞期胚胎中，所述gRNA的浓度为80～100ngμL，所述Cas9蛋白浓度为200ngμL，在受精2～4天后，分别将注射gRNA与Cas9蛋白的斑马鱼以及未注射的野生型斑马鱼胚胎基因组进行裂解，通过基因测序验证，获得tpi1a基因敲除的斑马鱼F0代；其中，所述敲除斑马鱼tpi1a基因的靶位点gRNA通过如下步骤制备：S11、根据确定的靶位点gRNA，设计并合成上游引物T7-tpi1a-F和下游引物T7-tpi1a-R，所述上游引物T7-tpi1a-F的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述下游引物T7-tpi1a-R的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；其中，所述gRNA位于tpi1a基因的第2个外显子上，所述gRNA的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；S12、以pMD19-gRNAscaffold质粒为模板，利用上游引物T7-tpi1a-F和下游引物T7-tpi1a-R进行PCR扩增，获得合成gRNA所需的双链DNA模板；S13、对DNA模板进行体外转录，制备gRNA；S14、将S13制备的gRNA进行纯化，获取纯净gRNA；S2、将获取的斑马鱼F0代饲养至成年，与野生型斑马鱼外交，获得-14bp型F1代斑马鱼；S3、将成熟的-14bp型F1代斑马鱼的雌、雄鱼进行内交，通过基因测序鉴定并筛选出斑马鱼tpi1a基因缺失突变体；所述斑马鱼tpi1a基因缺失突变体包括如SEQIDNO.6所示的核苷酸序列。

全文数据：

权利要求：

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