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申请/专利权人：四川大学

摘要：本发明公开了一种基于DTN和CRISPRCas12a的电感耦合等离子体质谱核酸检测方法，以至少一种HPV分型的核酸为靶标，所述核酸检测方法以DTN功能化的磁珠为载体，以CRISPR‑Cas12a复合体为靶标识别元件，以金属纳米粒子为报告探针，采用空间分离的CRISPR‑Cas12a对多重目标序列进行特异识别和对应底物探针切割，产生各靶标对应不同浓度的底物探针，通过与DTN功能化磁珠和金属报告探针共孵育，形成三明治结构，磁分离洗涤后，采用ICP‑MS同时采集磁珠表面的金属同位素信号，通过研究同位素信号强度和HPV‑DNA浓度的关系，实现对HPV‑DNA多重准确定量分析。本发明能够对HPV‑DNA进行多重准确定量分析，提高分析结果的准确性和可靠性。

主权项：1.一种基于DTN和CRISPRCas12a的电感耦合等离子体质谱核酸检测方法，其特征在于，以两种或三种HPV分型的核酸为靶标，所述核酸检测方法包括以下步骤：S1：获取金属纳米粒子和磁珠，采用巯基功能化的ssDNA对所述金属纳米粒子进行修饰，获得修饰金属纳米粒子；采用DTN对所述磁珠进行修饰，获得DTN修饰磁珠；当以两种HPV分型的核酸为靶标时，所述金属纳米粒子采用金纳米粒子和银纳米粒子；当以三种HPV分型的核酸为靶标时，所述金属纳米粒子采用金纳米粒子、银纳米粒子和铂纳米粒子；采用巯基功能化的ssDNA对所述金属纳米粒子进行修饰时，采用如SEQIDNO.1所示的DNA序列进行巯基功能化，然后对金纳米粒子进行修饰；采用如SEQIDNO.2所示的DNA序列进行巯基功能化，然后对银纳米粒子进行修饰；采用如SEQIDNO.3所示的DNA序列进行巯基功能化，然后对铂纳米粒子进行修饰；所述DTN为四条单链DNA合成的DNA四面体纳米结构，四条单链DNA分别为生物素修饰的ssDNA-A、生物素修饰的ssDNA-B、生物素修饰的ssDNA-C、ssDNA-D，所述ssDNA-D根据所述金属纳米粒子进行确定，选自ssDNA-DAu、ssDNA-DAg以及ssDNA-DPt；所述ssDNA-DAu的核酸序列如SEQIDNO.7所示，所述ssDNA-DAg的核酸序列如SEQIDNO.8所示，所述ssDNA-DPt的核酸序列如SEQIDNO.9所示；S2：将所述靶标对应CRISPR-Cas12a蛋白与crRNA进行混合，获得具有复合结构的复合物；S3：分别将相同体积不同浓度的HPV分型加入所述复合物中，并向各个混合物中加入Linker底物，在37℃条件下反应30~60min后，加热终止反应，获得反应产物；所述Linker底物根据所述金属纳米粒子选自LinkerAu、LinkerAg、LinkerPt，所述LinkerAu的序列如SEQIDNO.13所示，所述LinkerAg的序列如SEQIDNO.14所示，所述LinkerPt的序列如SEQIDNO.15所示；S4：将所述反应产物与DTN修饰磁珠进行混合孵育，然后进行磁性分离洗涤；S5：向步骤S4获得的产物中加入所述修饰金属纳米粒子进行混合孵育，形成三明治结构；S6：对所述三明治结构进行磁性分离洗涤去除上清液，用王水消解，并用纯水进行稀释，获得质谱采集溶液；S7：对所述质谱采集溶液进行电感耦合等离子体质谱检测，获取其中金属纳米粒子的同位素信号；S8：研究所述同位素信号的强度与HPV分型浓度的关系，获得HPV分型的检测结果。

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