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申请/专利权人：肇庆医学高等专科学校

摘要：本发明公开了一种肺癌相关分子靶点的发现方法，涉及肺癌技术领域。本发明包括收集样本并在在临床样本中检测DNAJB1表达与肺癌发生的关联性，以及分析与肺癌病人的生存率、药物敏感性的关联；明确HSF4DNAJB1对肺癌细胞的生长、增殖、转移和迁移的影响在肺癌细胞中研究HSF4DNAJB1p53调控网络以及下游效应分子，明确DNAJB1的分子靶标作用。本发明通过实验动物证明DNAJB1高表达导致肿瘤生长减慢，最后需要在临床样本中验证DNAJB1的相关性，进一步验证HSF4DNAJB1在肿瘤的迁移和侵袭中的作用，在细胞、组织与动物水平验证DNAJB1的分子靶标作用。

主权项：1.一种肺癌相关分子靶点的发现方法，其特征在于，包括：步骤一：收集样本并在临床样本中检测DNAJB1表达与肺癌发生的关联性，以及分析与肺癌病人的生存率、药物敏感性的关联，并进入步骤二；收集肺癌临床样本200例，所有病例通过临床、影像学、病理诊断，确诊为肺癌，详细记录病人的临床资料以及预后情况，对收集的肺癌组织进行石蜡包埋病理切片，使用免疫组化的方法观察HSF4和DNAJB1的分布和表达情况，分析HSF4DNAJB1与肺癌的关联性；对收集肺癌组织，取部分进行组织研磨，分别提取RNA和蛋白质；采用RT-PCR和免疫印迹方法检测HSF4和DNAJB1的mRNA和蛋白质表达水平，判断在不同肺癌样本中DNAJB1的表达情况；结合临床资料统计HSF4和DNAJB1在肺癌组织中表达程度与患者年龄，性别，肿瘤分期以及预后等指标的相关性；根据随访资料，分析DNAJB1与病人的生存率和生存时间的关联；步骤二：明确HSF4DNAJB1对肺癌细胞的生长、增殖、转移和迁移的影响，并进入步骤三；选择常见NSCLC细胞系A549、H1975、H1650及H1299，在A549、H1650、H1975及H1299的NSCLC细胞系中，分别构建DNAJB1缺失及过表达细胞系，使用《CCTop-CRISPR-Cas9targetonlinepredictor》设计靶向guideRNA，构建到PX459质粒中，筛选阳性单克隆，将DNAJB1的编码序列构建至pBABE载体，转染至p293T细胞进行病毒包装，加入puromycin进行筛选，3到5天后筛选阳性克隆，构建好的细胞系中使用PI单染流式细胞仪检测细胞的周期分布，有无周期阻滞情况，AnnexinV-FITCPI双染后用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况；稳定表达及缺失细胞系使用CCK8试剂盒检测细胞存活率；细胞以5000每孔的密度种在细胞培养板中，连续培养14天，统计克隆形成的数量；稳定表达、缺失及对照细胞系以一定浓度接种于细胞培养板，通过划痕实验观察DNAJB1对肺癌细胞迁移的影响；稳定表达、缺失及对照细胞系接种于细胞培养板，使用Matrigel处理小室内膜，加入血清饥饿培养12h后的细胞悬液，放培养箱培养12-36h后进行结晶紫染色，拍照分析迁移细胞数量，检测DNAJB1对肺癌细胞侵袭能力的影响；步骤三：在肺癌细胞中研究HSF4DNAJB1p53调控网络以及下游效应分子，明确DNAJB1的分子靶标作用，并进入步骤四；将DNAJB1含有HSE的启动子序列构建到pLC3-basic质粒中，构建好pLC3-DNAJB1-promoter质粒分别与对照、pcDNA3.1-myc-HSF4质粒及si-HSF4序列共转染细胞，36h后裂解细胞，用荧光素酶底物检测DNAJB1的转录活性；肺癌细胞转染pcDNA3.1-myc-HSF4质粒及si-HSF4序列及对照，36h后提取RNA及蛋白质，检测DNAJB1的RNA及蛋白变化，在A549细胞中，HSF4过表达上调DNAJB1的mRNA和蛋白水平，si-RNA序列干扰肺癌细胞的HSF4后，DNAJB1的表达下调，在H1650、H1975及H1299的NSCLC细胞系中继续验证HSF4对DNAJB1的转录调控，分别提取A549、H1650、H1975三个细胞系的mRNA和蛋白质，RT-PCR和免疫印迹检测HSF4、DNAJB1、MDM2及p53的含量；使用相应的抗体进行免疫共沉淀，检测HSF4或者DNAJB1与p53、MDM2有无相互作用同时荧光素酶实验和半衰期实验检测p53的转录活性和稳定性；对照、DNAJB1缺失和DNAJB1稳定表达四个细胞系中检测p53的蛋白变化，p53下游靶基因BAX、FAS、NOXA、PUMA及P21的表达，MET分子标记物E-cadherin、N-cadherin和MMP9的表达；步骤四：在小鼠肺癌模型中验证HSF4DNAJB1p53调控网络在肺癌的发生发展中的作用；将细胞系分组：对照组、DNAJB1过表达组、DNAJB1缺失组，将细胞制成单悬液，分别对4-6周无胸腺裸鼠每组5个重复进行皮下注射，每只鼠大约注射107个细胞，7天后观察实验小鼠体内肿瘤细胞的成瘤情况、肿瘤大小和重量，做好记录，绘制生长曲线，三周后处死裸鼠取得的肿瘤组织，拍照并称取瘤子的重量，取部分肿瘤分别研磨组织和做石蜡切片，利用免疫印迹和免疫组化方法检测HSF4、DNAJB1、MDM2及p53的分布和表达；同时检测细p53下游靶基因BAX、FAS、NOXA、PUMA及P21的表达，MET分子标记物E-cadherin、N-cadherin和MMP9，采用裸鼠尾静脉注射细胞的实验，观察DNAJB1对于原位肿瘤细胞肺部转移的影响，小鼠尾静脉注射对照组、DNAJB1过表达组、DNAJB1缺失组细胞，9周后处死老鼠，取肺组织，观察有无肿瘤转移。

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