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申请/专利权人：康圣序源生物科技(武汉)有限公司

摘要：本发明涉及一种适用于三代测序的海洋生物疑难样本DNA提取及文库构建方法，包括采用优化的CTAB法进行DNA的粗提取，随后加入CTAB二次裂解液以及RNase和蛋白酶K以充分去除RNA和其他可能携带的杂质，进一步采用特殊的PEGNaCl磁珠体系对低溶解度杂质进行去除，特别是在A260处也具有吸光度的“看不见”的杂质，最后，本发明选用特定浓度的PEGNaCl体系富集10‑20kb片段，用于三代测序中HiFi文库的构建，取得了更优的效果。相较优化前基本为0的数据产出，本发明所述DNA提取及建库方法进行三代测序时，数据产出量可高达1000Gb量级，具有广阔的应用价值。

主权项：1.一种适用于三代测序的海洋生物疑难样本DNA提取及文库构建方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、海洋生物样本的处理，S2、DNA的粗提取及纯化：A.加入成分为50-150mMTris,10-30mMEDTA,2％wvCTAB，1.2MNaCl的CTAB裂解液和蛋白酶K、RNase，加入等体积氯仿异戊醇抽提，颠倒混匀，离心沉淀杂质，吸上清加入一至三倍体积的CTAB沉淀buffer，其成分为50-150mMTris,10-30mMEDTA,2％wvCTAB，混匀，离心获得颗粒沉淀，乙醇洗涤，离心去除上清，干燥溶解，得到粗DNA；B.将所得粗DNA加入CTAB二次裂解buffer，其组分为Tris100mM,EDTA20mM,CTAB5％wv,NaCl1.2M，1％PVP，pH＝8，同时加入RNase和蛋白酶K进行孵育，加入等量氯仿异戊醇，颠倒混匀，离心吸上清，加入醋酸钠混合均匀，再用等体积的异丙醇沉淀DNA，离心收集DNA，去除上清液，乙醇清洗，即得纯化后的DNA；S3、DNA的进一步纯化：向DNA溶液中加入1V的污染物沉淀剂，所述污染物沉淀剂的组分为0.5-1MNaCl，5-15％PEG6000，Tris-HClpH＝8，EDTApH＝8和磁珠，充分混合，置于磁力架上静置吸附，将磁珠吸附完毕的上清液加入新的试管中，加入配置好的磁珠溶液，直至最终DNA:磁珠体积比为1:1，调整PEG和NaCl浓度为NaCl＝2M,PEG6000＝20-30％，随后进行磁珠纯化；S4、HiFi文库的构建；S5、上机测序。

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