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申请/专利权人：中国疾病预防控制中心营养与健康所

摘要：本发明涉及一种同时检测营养健康状况的多种蛋白质标志物的方法，检测方法包括：目标蛋白特异性抗体与检测平板所需要的磁珠结合，结合步骤具体如下：步骤1：试剂准备、步骤2：设备准备、步骤3：磁珠活化、步骤4：结合抗体、步骤5：封闭储存,步骤6：检测平板中多重蛋白质检测。通过实施本发明所获得的效果是：对能评价营养状况的蛋白质标志物的高通量检测，实现在一次检测中对多种评价人体营养状况的蛋白标志物的同时的准确检测，从而减小系统误差，提高对人体营养状况的系统、综合、精准的评价效果、提高检测效率；本发明对“贴膜振荡”环节与每孔对应的膜上位置涂沫石蜡；本发明中的封闭液、样本稀释液能整体性的提高检测效能。

主权项：1.一种非疾病诊断目的的同时检测营养健康状况的多种蛋白质标志物的方法，其特征在于，所述检测方法包括：目标蛋白特异性抗体与检测的磁珠结合，结合步骤具体如下：步骤1：试剂准备，选取适量磁珠、清洗液、活化液、PBS缓冲液、封闭液、储存液、目标蛋白特异性抗体和生物素标记的检测抗体备用；步骤2：设备准备，将设备准备好，调整至待机状态；步骤3：磁珠活化，将磁珠活化处理后得到活化磁珠；步骤4：结合抗体，将步骤3中活化后的磁珠，与目标蛋白的特异性抗体进行孵育；步骤5：封闭储存，将步骤4中结合抗体后的磁珠放于本专利保护的封闭液中对未结合位点进行封闭，经封闭后的磁珠加至储藏液后以2-8℃冷藏保存，所述封闭液为：45-50ml0.2-0.9molL三羟甲基氨基甲烷溶液与5-10ml0.1-1molL磷酸盐缓冲液，再加入5-10ml的100mM的NaCl,以纯净水定容至100ml，pH为6.8-7.2；步骤6：检测平板中多重蛋白检测，检测步骤具体如下：步骤6.1：磁珠加样，取9种在步骤1-5中与目标蛋白特异性抗体完成结合的磁珠，并向检测平板中，每个孔以每种磁珠0.25-0.5ul的量加入9种磁珠，并在每个孔中加入稀释液49.5-49.75ul，以实际需要的检测平板孔的数量为X个，则需要多增加8-10%X个检测平板孔，对这些孔同样添加磁珠预留备用，所述稀释液为：在0.8-0.9%的生理盐水中，加入终浓度为0.1-1molL的磷酸盐，终浓度为5-10mmolL的葡萄糖，终浓度为1-2mmolL的甘油三酯，终浓度为0.5-0.8%的小牛血清白蛋白配制而成；步骤6.2：抗原配制，将9种目标蛋白的抗原标准品用样本稀释液分别配制成实验所需要的浓度，其中：铁蛋白：1-100ngmL,转铁蛋白受体：0.1-10ugmL,视黄醇结合蛋白：1-100ugmL,C反应蛋白:1-100ugmL,前白蛋白：1-125ugmL,载脂蛋白B：1-200ugmL,D-二聚体：1-100ngmL,癌胚抗原：500-1000pgmL,甲胎蛋白：1-200ngmL，分别向步骤6.1中的检测平板孔内以每孔50-60ul的量进行加样；步骤6.3：结合反应，将步骤6.2中添加完抗原的检测平板，在表面贴敷石蜡膜；将贴好膜的检测平板置于室温避光条件下，以700-800rpm震荡孵育1-1.5h；步骤6.4：撕去石蜡膜后，清洗检测平板3次及3次以上；步骤6.5：用样本稀释液将生物素标记的检测抗体稀释至体积比为1:1000，将稀释后的检测抗体以每孔50-55ul的量加入至按步骤6.4清洗后的检测平板中；步骤6.6：将检测平板在室温避光条件下，在表面贴敷石蜡膜；将贴好膜的检测平板以700-800rpm震荡孵育30-40min；步骤6.7：撕去石蜡膜后，清洗检测平板3次及3次以上；步骤6.8：使用样本稀释液将SA-PE，即链霉亲和素的R-藻红蛋白偶联物按体积比1:100比例稀释，将稀释后的SAPE以每孔50ul的量加入至检测平板孔内；步骤6.9：将加入SAPE的检测平板贴敷石蜡膜后在室温避光条件下以700-800rpm振荡孵育15-20min；步骤6.10：撕去石蜡膜后，清洗检测平板3次及3次以上；步骤6.11：向检测平板孔内以每孔125-150ul的量添加样本稀释液后贴敷石蜡膜后，重悬微球；步骤6.12：将检测平板以1100-1400rpm振荡30秒钟后，在700rpm条件下，振荡10-15分钟后上机检测；步骤6.13：将处理好的检测平板撕去石蜡膜后，置于检测平板多重蛋白检测仪上进行检测，得到最终检测结果。

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权利要求：

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