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申请/专利权人：江苏省农业科学院宿迁农科所(宿迁市农业科学研究院)

摘要：本发明公开了一种通过苗期玉米叶片鉴定玉米亚油酸含量的方法，以高亚油酸玉米YM‑2和对照昌7‑2为材料，选用苗期叶片为实验对象，构建与优化玉米叶片的脂肪酸气相色谱质谱检测方法，成功区分出高亚油酸玉米和普通玉米，YM‑2中亚油酸和棕榈酸的含量，分别比对照昌7‑2多12.7%和20.7%，达到显著差异水平。本发明创制的玉米亚油酸含量的叶片检测方法，在之前从未报道，为实验者提供了一种新思路，对我国玉米品质改良及功能检测有着重要的应用价值，大大节约了科研人员的时间成本和经济成本。同时，也为需要用种子繁殖下一代继续进行后续实验研究提供了技术基础。

主权项：1.一种通过苗期玉米叶片鉴定玉米亚油酸含量的方法，其特征在于具体步骤为：1新鲜玉米叶片的收集和预处理，试验用玉米种质收集于江苏省农业科学院宿迁农科所，包括自主育成的高亚油酸玉米自交系YM-2和普通玉米自交系昌7-2，取其苗期叶片迅速置于液氮冷冻后，保存于-80℃冰箱备用；2苗期叶片前处理称取样品至100mL比色管中，试样水解加入2mL体积分数95％的乙醇和4mL水混合均匀，再加入10mL浓度为8.3molL的盐酸溶液混合均匀，将盛有混合液的烧瓶置于80℃水浴中水解40min，每隔10min振荡一下烧瓶，使黏附在烧瓶壁上的颗粒物混入溶液中，水解完成后取出样品冷却至室温；脂肪的提取：水解后的试样加入10mL体积分数95％的乙醇混合均匀，用100mL乙醚石油醚混合液体积比1:1分3次提取，合并提取液至100mL平底烧瓶中，将石油醚乙醚层蒸干获取脂肪提取物；脂肪的皂化和脂肪酸甲酯化：在脂肪提取物中加入4mL2wt％氢氧化钠的甲醇溶液，于45℃水浴锅中水浴20min，再加入4mL14wt％三氟化硼的甲醇溶液，于45℃水浴锅中水浴20min，水浴完成后待温度降到室温，在离心管中加入3mL正己烷，震荡萃取2min之后静置等待分层，取上层清液，用0.45μm滤膜过滤后上机测试；3脂肪酸成分分析气相色谱-气质联用仪GC-MS分析条件如下：载气为氮气，进样量1μL，进样口温度260℃，载气流速：0.63mLmin，分流比：100:1，检测器温度280℃，传输线温度：240℃，溶剂延迟4min，升温程序：80℃保持1min；以20℃min的升温速率升温至160℃，保持1.5min；再以5℃min的升温速率升温至230℃，保持6min，各化合物依据沸点的不同得到分离，经过GC-MS检测，使用软件MassHunter，通过MS得到其离子峰，根据质谱库对离子进行鉴定，同时采用软件MassHunter对化合物峰面积进行积分，定量分析脂肪酸；4计算公式各脂肪酸的含量按公式计算:其中：W-试样中各脂肪酸的含量，单位为g100g；C-试样测定液中脂肪酸甲酯的浓度，单位为mgL；V-定容体积，单位为mL；K-各脂肪酸甲酯转化为脂肪酸的换算系数，参见下表；N-稀释倍数；10-4-单位换算系数；M-试样的称样质量，单位为g；各脂肪酸种类、检出限及脂肪酸甲酯或脂肪酸甘油三酯转换为脂肪酸的换算系数如下表所示： 5对高亚油酸玉米自交系YM-2和普通玉米自交系昌7-2的叶片中，如表所示的37种脂肪酸含量进行检测和计算，构建玉米苗期叶片脂肪酸气相色谱-质谱检测方法，通过快速、准确地鉴定玉米苗期叶片中脂肪酸各组分的含量，从而成功区分出高亚油酸玉米自交系和普通玉米自交系；6利用构建的玉米苗期叶片脂肪酸气相色谱质谱检测方法进行YM-2和昌7-2脂肪酸含量的测定，三次生物学重复的结果表明YM-2的亚油酸C18:2n6c含量比昌7-2高12.7％，棕榈酸C16:0含量多20.7％，硬脂酸C18:0含量多15.3％，α-亚麻酸C18:3n3含量多14.2％，从而将高亚油酸自交系和普通玉米自交系区分开。

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