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申请/专利权人：常州市第一人民医院

摘要：本发明提出了UFP‑512在线粒体保护、自噬诱导方面的应用，并且提出UFP‑512在制备用于预防、延缓或者治疗与线粒体相关或受线粒体影响的病症的药物中的用途，实验数据表明，UFP‑512能够有效改善线粒体膜电位去极化，增加线粒体ATP产出，降低细胞氧化应激压力。同时，UFP‑512能够诱导依赖于PINK1‑Parkin的线粒体自噬，从而进一步清除受损的线粒体，维持线粒体内环境稳定，UFP‑512对线粒体的靶向保护作用和对线粒体自噬的诱导作用弥补了与线粒体损伤、线粒体自噬障碍有关的疾病方面的应用空白。

主权项：1.UFP-512的新用途，其特征在于：所述UFP-512用于线粒体保护剂。

全文数据：UFP-512的新用途技术领域本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及UFP-512用于线粒体保护、线粒体自噬诱导以及在制备用于预防、延缓或者治疗与线粒体相关或受线粒体影响的病症的药物中的用途。背景技术线粒体广泛存在于各种真核生物的细胞中，是人体重要的能量工厂。线粒体通过在其内膜氧化磷酸化耦合电子传送链，产生ATP，源源不断的向机体提供能量。除了合成机体90％的ATP，线粒体还参与了一系列重要的代谢过程，包括脂肪酸氧化，铁代谢，尿素循环和钙的储存。线粒体在人类的生长发育，疾病，死亡等多个方面发挥重要作用。大量研究表明，许多疾病的发生，如II型糖尿病、神经退行性疾病以及肿瘤都与线粒体功能的障碍息息相关。其中线粒体的破坏以及线粒体自噬障碍在脑组织中的影响尤为明显。神经退行性疾病是一类严重危害人类健康的神经疾病。其中包括帕金森氏病PD、阿尔兹海默症AD、肌萎缩性侧索硬化症ALS以及亨廷顿舞蹈症HD。尽管这些疾病存在不同的运动障碍以及认知障碍临床表征，但相同点在于，它们的发病率都随年龄而快速增长。而蛋白的异常聚集，神经元细胞的破坏以及线粒体功能的障碍是它们共同的病理特征。早在70年代后期，研究便发现MPTP一种能够诱发PD样症状的神经毒物可以在体内氧化为MPP+，选择性地被多巴胺能神经元摄取，引起线粒体呼吸链重要组成部分——线粒体复合物活性的抑制。相应的，线粒体复合物的损伤也在PD患者的大脑，骨骼肌肉和血小板中被检出，提示线粒体的损伤可能参与了PD的发生发展。除了神经退行性疾病的致病性神经毒物对线粒体的影响，一些与神经退行性疾病相关的基因产物也与线粒体的功能与调节息息相关。比如，生物化学和基因学研究揭示了PINK1PTEN-inducedkinase1和Parkin突变与常染色体隐形遗传PD间存在的直接因果关系。同时，PINK1和Parkin也是线粒体质控系统中关键的蛋白分子。而在常染色体显性遗传PD中，基因突变如LRRK2、VPS35、CHCHD2、GBA和一些环境因素的共同作用可导致α突触核蛋白的异常聚集与错叠，毒性α突触核蛋白能够破坏线粒体功能，降低ATP生成的同时促进活性氧的释放。与正常老年人相比，PD患者黑质细胞中线粒体DNA突变水平显著提高，线粒体碎片明显增多。AD是以进行性记忆减退和认知功能障碍为特征的神经退行性疾病。大脑皮质和皮质下脑区神经元和突触进行性的丢失直接导致AD患者大脑广泛性的萎缩。而神经元周围淀粉样斑块的形成和tau蛋白过度磷酸化造成的神经元纤维缠结是AD最主要的两个病理特征。除了这些明显的病征以外，科学家经过深入研究，发现AD患者的脑组织内出现线粒体DNA的断裂，线粒体复合物I、III、IV活性的变化。电镜观察显示线粒体数目增加，结构异常，出现层状体和晶状包含体，另外还伴有氧自由基增多，活性氧水平增高等。而HD和ALS的临床证据进一步显示，患者体内，尤其是大脑和骨骼肌中普遍存在葡萄糖代谢减退，能量供应的匮乏，以及线粒体复合物II，III活性的下降。神经退行性疾病大多累及机体的多个系统，至今尚无有效的治疗方法能够延缓或者治愈这些疾病，临床常用药物仅能够在病程早期改善患者的临床症状。因此，现代医学认为，神经退行性疾病的一个有效的治疗策略是选择性地针对不同的病理损伤进行多种药物联合的靶向治疗。发明内容本申请的发明人意外发现，UFP-512作为一种特异性的δ阿片受体激动剂，能够通过调控PINK1作用于线粒体，通过深入研究，进而提出了UFP-512在作为线粒体保护剂和线粒体自噬诱导剂方面的应用，以及提出了UFP-512在制备用于预防、延缓或者治疗与线粒体相关或受线粒体影响的病症的药物中的用途，UFP-512其结构式名为：S-3-S-2R-2-amino-3-4-hydroxy-2,6-dimethylphenylpropanoyl-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-3-carboxamido-3-1H-benzo[d]imidazol-2-ylpropanoicacid。优选的，UFP-512在制备用于预防、延缓或者治疗神经退行性疾病或II型糖尿病或肿瘤疾病的药物中的应用。优选的，所述神经退行性疾病选自阿尔兹海默症AD、肌萎缩性侧索硬化症ALS以及亨廷顿舞蹈症HD。优选的，所述UFP-512的结构式为：优选的，所述UFP-512作为制备用于预防、延缓或者治疗与线粒体相关或受线粒体影响的病症的药物中以的结构、或药学上可接受的盐、或其前药的形式存在。优选的，所述UFP-512以1mgkg的剂量被使用。UFP-512是一种可溶于甲醇、乙醇、DMSO等有机溶剂的化合物。本发明提出了UFP-512在作用于线粒体方面的应用，并且经过实验强有力地论证了UFP-512对线粒体的靶向保护作用，以及对于线粒体自噬的诱导作用，UFP-512弥补了在神经退行性损伤中对抗线粒体破坏，线粒体自噬障碍这一块的应用，有望开发为新的线粒体保护，线粒体自噬诱导剂，尤其是针对神经退行性疾病造成的线粒体损伤，线粒体自噬障碍方面的应用。附图说明图1为UFP-512的结构式；图2为TMRM荧光染色检测UFP-512对线粒体膜电位影响的数据图；图3为UFP-512对线粒体ATP生成影响的数据图；图4为UFP-512对线粒体氧化应激压力和细胞凋亡水平影响的数据图；图5为UFP-512对PINK1的调控数据图；图6为UFP-512对Parkin的含量的影响数据图；图7为UFP-512对线粒体自噬诱导作用的验证数据图。具体实施方式下面将结合本发明实施例进一步的阐述本发明应用的科学论证，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。为了论证UFP-512可作为线粒体保护剂的应用，采取以下几种试验进行证明。如图2所示，采用TMRM荧光染色法来对UFP-512对线粒体膜电位的影响做出评价，为了清楚的表达UFP-512对线粒体膜电位的作用效果，采用四组对照试验，其中四组分别为C组：细胞对照组；M组：MPP+处理组；M+U组：1.0mMMPP++5μMDOR激动剂UFP-512处理组；M+U+N组：1.0mMMPP++5μMDOR激动剂UFP-512+1μMDOR抑制剂那曲吲哚处理组。上述几组的制备方式为：对照组为正常培养的PC12细胞；MPP+处理组为在细胞传代24小时后，更换已加入1.0mMMPP+神经毒物的新培养液，重新放入正常培养箱，培养24h后制备；M+U组：在细胞传代24小时后，更换新培养基，新培养基中加入DOR特异性激动剂UFP-5125μmolL；M+U+N组：在细胞传代24小时后，更换新培养基，新培养基中同时加入DOR特异性激动剂UFP-5125μmolL和DOR特异性抑制剂那曲吲哚1μmolL。图2a为显微镜下的几组荧光照片，荧光强度变弱提示线粒体膜电位下降，综合图2b的流式分析可知，加入MPP+显著降低了线粒体膜电位，而UFP-512的加入则有效改善了MPP+损伤造成的线粒体膜电位的破坏，说明UFP-512在一定程度上起到了对线粒体的保护作用。图3通过检测ATP生成水平的变化验证UFP-512对线粒体功能的影响，采用五组对照试验，其分别为：C组：细胞对照组；CCCP组：阳性对照组；M组：1.0mMMPP+处理组；M+U组：1.0mMMPP++5μMDOR激动剂UFP-512处理组；M+U+N组：1.0mMMPP++5μMDOR激动剂UFP-512+1μMDOR抑制剂那曲吲哚处理组。利用ATP试剂盒检测各组的细胞ATP生成水平，并绘制成图。如图3所示，可以直观的看出，CCCP组即阳性对照组和M组线粒体ATP生成水平显著降低；UFP-512有效改善了MPP+损伤情况下线粒体功能，提高了线粒体ATP生成能力，提示UFP-512对线粒体起到了保护作用。图4通过检测UFP-512对线粒体氧化应激压力和细胞凋亡水平的影响来进行评价UFP-512的神经保护作用，采用四组对照试验，分别为：C组：对照组；M组：1.0mMMPP+处理组；M+U组：1.0mMMPP++5μMDOR激动剂UFP-512处理组；M+U+N组：1.0mMMPP++5μMDOR激动剂UFP-512+1μMDOR抑制剂那曲吲哚处理组。在常氧MPP+条件下，对各组细胞使用MitoSOX试剂检测活性氧水平，Westernblot检测线粒体内外细胞色素c表达水平，线粒体中COXIV做内参，胞浆中β-actin做内参。图4中的图4a为荧光染色照片，图4b为MitoSOX荧光染色检测线粒体过氧化物水平流式分析图，其中MitoSOX荧光强度增加提示线粒体过氧化物水平提高，线粒体氧化应激压力增加。表明，MPP+显著增加了线粒体氧化应激压力，UFP-512有效清除了线粒体过氧化物，降低了线粒体所面对的氧化应激压力。图4c为Westernblot检测细胞凋亡信号分子Cytochromec由线粒体至胞质中的释放水平，MPP+处理显著提高了cytochromec在胞质中的含量，提示细胞凋亡的启动，而UFP-512的加入显著下调了Cytochromec的释放，进一步证明了UFP-512在线粒体中的保护作用。为了论证UFP-512可作为线粒体自噬诱导剂的应用，采取以下几种试验进行证明。首先通过四组对照试验来对比不同浓度MPP+处理PC12细胞对于PINK1表达影响以及UFP-512对PINK1的调控作用进行评价。其分别为：C组：细胞对照组；M组：1.0mMMPP+处理组；M+U组：1.0mMMPP++5μMDOR激动剂UFP-512处理组；M+U+N组：1.0mMMPP++5μMDOR激动剂UFP-512+1μMDOR抑制剂那曲吲哚处理组。使用0.5-2.0mMMPP+处理细胞24小时，在常氧MPP+条件下，Westernblot检测各组细胞总蛋白PINK1表达水平，β-actin做参照，得如图5所示，PINK1表达水平随MPP+浓度增加而下降。UFP-512在1.0-2.0mMMPP+处理过的细胞中有效地上调了PINK1的表达水平。第二，在常氧MPP+条件下，Westernblot检测各组细胞线粒体蛋白中Parkin表达水平，线粒体中COXIV做内参，胞浆中β-actin做内参。同时检测胞质中Parkin表达水平，β-actin做参照。依然分为四组试验，C组：细胞对照组；M组：1.0mMMPP+处理组；M+U组：1.0mMMPP++5μMDOR激动剂UFP-512处理组；M+U+N组：1.0mMMPP++5μMDOR激动剂UFP-512+1μMDOR抑制剂那曲吲哚处理组。Westernblot分别检测胞质和线粒体中Parkin的表达水平，结果如图6所示，MPP+导致了Parkin在线粒体和胞质中全方位的减少，而UFP-512的加入则显著增加了线粒体中Parkin的含量，同时减少了胞质中Parkin的含量，提示UFP-512促进Parkin由胞质向线粒体的转移。另外为进一步验证UFP-512介导的线粒体自噬是否依赖于PINK1-Parkin信号通路，在常氧MPP+条件下，Westernblot检测各组细胞COXII表达水平变化，β-actin做参照。在常氧MPP+条件下，各组细胞使用DNA提取试剂盒分别提取细胞总DNA，使用线粒体DNAmtDNA引物，PCR扩增mtDNA。使用核DNAnDNA引物，PCR扩增nDNA.以nDNA为对照，检测细胞mtDNA含量。七组分别为：C组：细胞对照组；CCCP组：阳性对照组；C+U组：正常条件下加入5μMDOR激动剂UFP-512；C+U+N组：正常条件下加入5μMDOR激动剂UFP-512和1μMDOR抑制剂那曲吲哚；M组：1.0mMMPP+处理组；M+U组：1.0mMMPP++5μMDOR激动剂UFP-512处理组；M+U+N组：1.0mMMPP++5μMDOR激动剂UFP-512+1μMDOR抑制剂那曲吲哚处理组。图7a为PCR检测线粒体DNAmtDNA表达水平。在CCCP或加入UFP-512的情况下，mtDNA表达水平显著下降，提示线粒体被清除，线粒体自噬发生。图7b为Westernblot检测线粒体内膜蛋白COXII表达水平，COXII的降解提示线粒体自噬发生。同样在CCCP或UFP-512处理细胞后，COXII有效被降解，提示线粒体自噬发生。图7c：免疫荧光检测线粒体和Parkin共定位情况。该检测目的在于验证UFP-512介导的线粒体自噬是否依赖于PINK1-Parkin信号通路，根据图7可知，在加入CCCP和加入UFP-512后，线粒体与Parkin共定位显著增加。综合图5，图6和图7表达的内容，UFP-512显著上调PINK1表达水平，促进Parkin从胞质向线粒体的转移，确信UFP-512介导的线粒体自噬依赖于PINK1-Parkin信号通路，从而证明了UFP-512在能作为线粒体自噬诱导剂方面的应用。实施例2，如背景技术中的记载的II型糖尿病、神经退行性疾病以及肿瘤都与线粒体功能的障碍息息相关，所以UFP-512具有在制备用于预防、延缓或者治疗与线粒体相关或受线粒体影响的这些病症的药物方面的应用前景。并且UFP-512通过调控线粒体自噬，保护线粒体，可从而有效地对抗多种神经元的损伤，在多种细胞损伤模型中，特别是神经退行性疾病，如对于阿尔兹海默症AD、肌萎缩性侧索硬化症ALS以及亨廷顿舞蹈症HD等神经退行性疾病，而且UFP-512能够有效改善线粒体膜电位去极化，增加线粒体ATP产出，降低氧化应激压力，同时UFP-512能够诱导依赖于PINK1-Parkin的线粒体自噬，从而进一步清除受损的线粒体，维持线粒体内环境稳定。另外，由于UFP-512可溶于甲醇、乙醇、DMSO等有机溶剂以及其的结构，所以可通过适当的化学反应制备以盐的形式如钠盐、或者前药的形式来应用，而且在动物实验中目前使用剂量为1mgkg小鼠体重，未见异常。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

权利要求：1.UFP-512的新用途，其特征在于：所述UFP-512用于线粒体保护剂。2.UFP-512的新用途，其特征在于：所述UFP-512用于线粒体自噬诱导剂。3.UFP-512的新用途，其特征在于：所述UFP-512在制备用于预防、延缓或者治疗与线粒体相关或受线粒体影响的病症的药物中的用途。4.根据权利要求3所述的UFP-512的新用途，其特征在于：所述病症为神经退行性疾病或II型糖尿病或肿瘤疾病。5.根据权利要求4所述的UFP-512的新用途，其特征在于：所述神经退行性疾病选自阿尔兹海默症AD、肌萎缩性侧索硬化症ALS以及亨廷顿舞蹈症HD。6.根据权利要求1或2所述的UFP-512的新用途，其特征在于，所述UFP-512的结构式为：7.根据权利要求3所述的UFP-512的新用途，其特征在于，所述UFP-512作为制备用于预防、延缓或者治疗与线粒体相关或受线粒体影响的病症的药物中以的结构、或药学上可接受的盐、或其前药的形式存在。8.根据权利要求6所述的UFP-512的新用途，其特征在于，所述UFP-512以1mgkg的剂量被使用。

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