申请/专利权人：湖南农业大学

申请日：2019-07-26

公开（公告）日：2022-06-21

公开（公告）号：CN110241235B

主分类号：C12Q1/6888

分类号：C12Q1/6888;C12N15/60

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2022.06.21#授权;2019.10.15#实质审查的生效;2019.09.17#公开

摘要：本发明公开了一种腺苷琥珀酸裂解酶ADSL基因及其用作溆浦鹅肌肉中肌苷酸含量的遗传标记，通过测定溆浦鹅胸肌中肌苷酸含量高低，并筛选溆浦鹅ADSL基因多态性，然后将ADSL基因多态性与胸肌肌苷酸性状作关联性分析，发现在溆浦鹅ADSL基因如序列所示，在146bp处存在一个GT突变，GG和TT基因型溆浦鹅胸肌肌苷酸含量显著高于GT基因型。本发明为溆浦鹅胸肌肌苷酸性状的标记辅助选择提供了分子标记。

主权项：1.一种用SEQIDNO:1所示的ADSL基因作为溆浦鹅肌苷酸性状相关遗传标记的方法，其特征在于，包括如下步骤：1在GenBank下载鹅ADSL基因序列，用Primer5.0设计引物，覆盖该基因外显子9至外显子10全部序列；2以溆浦鹅基因组DNA为模板，PCR扩增，产物纯化，反向测序一个反应，获得如序列表SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；3鉴定该基因序列第146bp是否存在G-T突变，GG和TT基因型溆浦鹅胸肌肌苷酸含量高于GT型个体。

全文数据：ADSL基因及用作溆浦鹅肌苷酸含量的遗传标记方法技术领域本发明属于家禽分子生物技术及育种领域，主要是用于测定溆浦鹅肌肉中肌苷酸含量相关的遗传标记，具体地说是，是测定ADSL基因中的多态性，即与溆浦鹅肌苷酸性状相关的腺苷琥珀酸裂解酶基因的单核苷酸多态性Singlenucleotidepolymorphism，缩写为SNP的存在。技术背景溆浦鹅作为地方品种资源，其肉质鲜美，富含人体必须的营养素，对人体健康十分有益。鹅肉营养丰富，富含人体必需的多种氨基酸、蛋白质、多种维生素、糖、微量元素，并且脂肪含量很低，不饱和脂肪酸含量高，容易被人体消化吸收。2002年联合国粮农组织将鹅肉列为21世纪重点发展的绿色食品之一，得到了广大消费者的喜爱。由于溆浦鹅缺乏科学系统选育，导致鹅肉肌苷酸含量个体差异大，严重制约了鹅产业化发展、影响产品品质和经济效益。常规选育较慢，随着生物分子技术的发展，使得我们能够从DNA水平寻找与溆浦鹅鹅肉肌苷酸性状相关的主效基因或分子标记，并在育种中将其应用于标记辅助选择，提高选育进程，获得更大的经济效益。肌苷酸inosinemonophosphate，IMP是鲜味物质的主要成分，目前国际上普遍将肌苷酸作为衡量肌肉鲜味的重要指标。IMP在体内合成需经历一个复杂的过程，包括从头合成和补救合成两条通路，需要10种酶的参与，其中腺苷琥珀酸裂解酶基因adenylosuccinatelyase,ADSL是催化嘌呤第8步反应的关键酶，其属于天冬氨酸酶延胡索酸酶超级家族成员，可在同一活化位点催化两个非连续的反应：1催化氨基咪唑琥珀基氨甲酰核苷酸aminoimidazolesuccinylocarboxamideribonuleotide,SACIAR生成氨基咪唑氨甲酰核苷酸aminoimidazolecarboxamideribonucleotide,AICAR，2催化腺苷酸琥珀酸单磷酸转化生成腺苷酸单磷酸，这两个催化反应均对IMP生成具有重要作用。自Jaeken和Berghe发现第一个ADSL缺陷病人以来，目前已在ADSL基因上找到50多处致病效应位点突变，因而对IMP合成的限速酶ADSL的研究还主要集中在生理、病理和免疫等领域。目前，张学余等对泰和乌骨鸡、隐性白羽肉鸡研究初步探明了ADSL基因与IMP含量的相关性。束婧婷等研究表明ADSL基因的外显子2的核苷酸变异与肌肉IMP含量有关。石浩等在米易鸡ADSL基因第9外显子上发现与IMP含量显著相关的SNP位点。溆浦鹅DNA遗传标记、遗传多样性和相关功能基因的研究仍处于起步阶段，关于溆浦鹅IMP相关的遗传标记尚未见报道。发明内容针对上述现有技术的不足，提供一种ADSL基因及其作为溆浦鹅胸肌肌苷酸性状遗传标记的用途；同时筛选与溆浦鹅胸肌肌苷酸性状相关的SNP，以期应用于标记辅助选择或标记辅助渗入，并提供上述遗传标记在溆浦鹅标记辅助选择中的应用。本发明实施例是这样实现的，一种ADSL基因，所述基因为与表示溆浦鹅胸肌肌苷酸含量性状相关的基因。进一步，所述基因第146bp有一处碱基突变G→T。检测与溆浦鹅肌苷酸性状相关ADSL基因序列第146bp处突变的引物对，所述引物序列如下：正向引物：5’—CACCCATAAAGGGAACAG—3’反向引物：5’—AGCACAGACAGCCAGATT—3’。本发明实施例的另一目的在于提供一种用ADSL基因作为溆浦鹅胸肌肌苷酸性状相关遗传标记的方法，该包括如下步骤：1根据GenBank中鹅ADSL基因的序列，用Primer5.0设计引物，覆盖该基因全部外显子9至外显子10全部序列；2以上述溆浦鹅基因组DNA为模板，PCR扩增，产物纯化，克隆，获得如序列表SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；3鉴定该基因序列第146bp是否存在突变。进一步，所述方法选择溆浦鹅作为研究对象，采用分子生物学的方法筛选溆浦鹅胸肌肌苷酸性状相关基因，其步骤如下：1选择相同批次80日龄健康溆浦鹅60只进行饲养试验；2根据ADSL基因的序列设计引物，对样品进行扩增、测序；3筛选与肌苷酸性状相关的SNP。溆浦鹅胸肌肌苷酸相关基因SNP筛选选择相同日龄的健康溆浦鹅60只进行填饲试验。28天后进行屠宰，通过高效液相色谱检测胸肌中肌苷酸含量，并从肌苷酸含量高和肌苷酸含量低的样本中分别提取其基因组DNA。根据GenBank中鹅ADSL基因序列，用Primer5.0设计引物，覆盖该基因外显子9至外显子10全部序列，引物序列为：正向引物：5’—CACCCATAAAGGGAACAG—3’反向引物：5’—AGCACAGACAGCCAGATT—3’引物由湖南擎科生物技术有限公司合成。用上述引物分别对溆浦鹅基因组DNA进行扩增。PCR：20μl反应体系：2×Mastermix12μl，上下游引物10μmolL各0.8μl，DNA模板1μl，超纯水补至所需体积。PCR扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，57.6℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃后延长10min，最后4℃保存。取PCR产物5μl进行凝胶电泳，检测产物片段大小是否符合目的片段大小，PCR产物的长度为1255bp。取PCR扩增产物30μl，产物纯化后送湖南擎科生物技术有限公司测序，反向测序一个反应，测序结果确证了PCR产物是ADSL基因，序列如序列表中的SEQIDNO：1所示。图1是突变位点和测序峰图。上述实验结果表明，从溆浦鹅胸肌中提取相关基因为ADSL基因，并且在该基因序列中筛选到与胸肌肌苷酸含量有关的SNP，很可能这就是影响溆浦鹅肌苷酸含量高低的原因。本发明采用PCR与DNA测序结合的方法首先筛选出ADSL基因为溆浦鹅肌苷酸性状的相关基因，继而从溆浦鹅ADSL基因上筛选到与性状相关的SNP，并且通过生产实践验证确定ADSL基因为胸肌肌苷酸含量相关基因，筛选的SNP为与之相关的SNP。本发明筛选的溆浦鹅ADSL基因的SNP可作为溆浦鹅辅助选择的遗传标记，从而培育出胸肌中肌苷酸含量更高，肌肉品质更鲜的溆浦鹅，具有极其重大的应用价值和经济效益。附图说明图1为突变位点和测序峰图。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例1溆浦鹅胸肌肌苷酸相关基因SNP筛选选择相同日龄的健康溆浦鹅60只进行填饲试验。28天后进行屠宰，通过高效液相色谱检测胸肌中肌苷酸含量，并从肌苷酸含量高和肌苷酸含量低的样本中分别提取其基因组DNA。根据GenBank中鹅ADSL基因序列，用Primer5.0设计引物，覆盖该基因外显子9至外显子10全部序列，引物序列为：正向引物：5’—CACCCATAAAGGGAACAG—3’反向引物：5’—AGCACAGACAGCCAGATT—3’引物由湖南擎科生物技术有限公司合成。用上述引物分别对溆浦鹅基因组DNA进行扩增。PCR：20μl反应体系：2×Mastermix12μl，上下游引物10μmolL各0.8μl，DNA模板1μl，超纯水补至所需体积。PCR扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，57.6℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃后延长10min，最后4℃保存。取PCR产物5μl进行凝胶电泳，检测产物片段大小是否符合目的片段大小，PCR产物的长度为1255bp。取PCR扩增产物30μl，产物纯化后送湖南擎科生物技术有限公司测序，反向测序一个反应，测序结果确证了PCR产物是ADSL基因，序列如序列表中的SEQIDNO：1所示。图1是突变位点和测序峰图。上述实验结果表明，从溆浦鹅胸肌中提取相关基因为ADSL基因，并且在该基因序列中筛选到与胸肌肌苷酸含量有关的SNP，很可能这就是影响溆浦鹅肌苷酸含量高低的原因。实施例2与溆浦鹅胸肌肌苷酸含量有关的SNP在生产实践中的验证选择80日龄及相同饲养管理条件的健康溆浦鹅20只进行试验。28天填饲后，所有供试溆浦鹅进行屠宰，检测胸肌中肌苷酸含量。用提取的20只溆浦鹅胸肌组织样基因组DNA，并利用实施例1中的引物扩增，并按照实施例1的方法检测其SNP。表1PCR反应体系PCR循环参数如下：95℃预变性5min；95℃变性30s，57.6℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃后延长10min，最后4℃保存。ADSL基因SNP位点基因型频率分析通过卡方检验突变位点基因型频率与等位基因频率，结果如表2所示，该位点处于Hardy-Weinberg平衡中P0.05。表2SNP位点基因型和基因频率ADSL基因与溆浦鹅肥肝性状的相关分析分析不同SNP基因型对溆浦鹅胸肌肌苷酸含量的影响，从表3可见，不同SNP基因型对溆浦鹅胸肌肌苷酸性状有显著影响，其中，GG和TT基因型溆浦鹅胸肌肌苷酸含量高于GT型个体31.65％和25.23％，差异达到显著水平P湖南农业大学ADSL基因及用作溆浦鹅肌苷酸含量的遗传标记方法1PatentInversion3.11445DNA鹅（goose）mutation146k=t或g1tttgcagcacaagtgtaatattaataactctgtgtgagtgggaagagaacaaagaaagat60gggatattcaggacaagaacccagaagcttttgtttctcaggagtgaaacatcaggaagt120gaaaaaaggtatttttgaattcattkgtacctgacgattgcctcctgctttcaccatcgc180catgattatattctctgtggccatgaatggaagctcctgccggatccttctgtcaatcac240cttaaaaaaaaacaaaacaaaacaacaaaccagaaaaaaagagaaacagcattacaggaa300ttcttgtagacaaccgtgattcctggtgaagttttcctctccttttgaatccccaggact360gtgcagtgatgaaaaggtaattactgtttttgagcttagctcaaaatctattgaagctga420taataaaaactgaactttctatgga445

权利要求：1.一种与溆浦鹅肌苷酸含量性状相关的ADSL基因，其特征在于，所述基因如序列表SEQIDNO.1所示，在ADSL基因第146bp处有G→T的突变，导致多态性存在。2.如权利要求1所述的与溆浦鹅肌苷酸含量性状相关的ADSL基因，其特征在于，检测与溆浦鹅肌苷酸性状相关ADSL基因序列第146bp处突变的引物对，所述引物序列如下：正向引物：5’—CACCCATAAAGGGAACAG—3’反向引物：5’—AGCACAGACAGCCAGATT—3’。3.一种用ADSL基因作为溆浦鹅肌苷酸性状相关遗传标记的方法，其特征在于，包括如下步骤：1在GenBank下载鹅ADSL基因序列，用Primer5.0设计引物，覆盖该基因外显子9至外显子10全部序列；2以溆浦鹅基因组DNA为模板，PCR扩增，产物纯化，反向测序一个反应，获得如序列表SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；3鉴定该基因序列第146bp是否存在突变。4.选择溆浦鹅作为研究对象，采用分子生物学的方法筛选溆浦鹅肌苷酸性状相关基因，其特征在于，其步骤如下：1选择相同批次80日龄健康溆浦鹅60只进行饲养试验；2根据ADSL基因的序列设计引物，对样品进行扩增、测序；3筛选与肌苷酸性状相关的SNP。

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