申请/专利权人：安徽梅赛泰生物科技有限公司

申请日：2023-01-05

公开（公告）日：2023-05-16

公开（公告）号：CN116121238A

主分类号：C12N15/10

分类号：C12N15/10;C12P19/34

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2023.06.02#实质审查的生效;2023.05.16#公开

摘要：本发明公开了一种dsDNA抗原的制备方法，包括以下几个步骤，制备细胞核；裂解细胞核；解离DNA—蛋白质复合体去除组蛋白；提取DNA；双链DNA片段化处理；酶切处理；dsDNA浓缩；dsDNA回收。本方法采用超声的方式对双链DNA进行片段化处理，相对于酶切法，节约了成本，降低了实验操作中的损耗，配合优化后的超声参数，可以更快速高效地得到所需片段化dsDNA，增加了真空离心浓缩的步骤，提高了dsDNA的浓度，从而提高了回收得率，双链DNA的提取以试剂法代替柱式提取法，成本更低。与此同时，对传统的试剂法进行了改良，以丙酮代替酚‑氯仿进行DNA进行沉淀处理，降低了实验操作中对人和环境的危害。

主权项：1.一种dsDNA抗原的制备方法，其特征在于：包括以下几个步骤，1制备细胞核：取小牛胸腺或猪脾在冰块上去除脂肪和结缔组织后称取适量10g切碎放入匀浆仪，加入缓冲液A去除组织中的RNA-蛋白质复合体，用匀浆仪匀浆，将匀浆后溶液分装平衡后，用高速冷冻离心机离心，弃去上清，将沉淀置于小烧杯，再次加入缓冲液A并匀浆、离心然后弃去上清，取出沉淀加缓冲液B为细胞核的裂解提供合适反应环境，再次匀浆得到悬浮液；2裂解细胞核：将悬浮液移入烧杯中，在磁力搅拌器上边搅拌边滴入8ml的20％SDS，用55℃水浴温热15min，然后在搅拌下缓慢加入10gNaCl，再搅拌10min，使NaCl全溶，冷却至室温；3解离DNA—蛋白质复合体去除组蛋白：将步骤2溶液倒入三角瓶中，加入30mL积的缓冲液C，剧烈振荡10min，4℃，10000rmin，离心10min。用滴管取出上层水相，并重复加缓冲液C解离DNA—蛋白质复合体，使蛋白沉淀，振荡、离心，至中层界面无混浊为止；4提取DNA：将步骤3取出的水相滴入预冷的95％乙醇中，边滴加边用玻璃棒搅拌起白色纤维状DNA沉淀，将白色纤维状DNA沉淀置于培养皿中，依次用95％乙醇和无水乙醇清洗DNA沉淀至无浑浊为止，最后再用丙酮清洗一次，37℃烘干后以1mL的缓冲液，缓冲液为0.01MPBS，pH7.4，溶解；5双链DNA片段化处理：检测DNA浓度，稀释到浓度为500ngul用以后续超声，得到片段化DNA，经琼脂糖电泳检测，该片段化DNA大小主要为200bp-2000bp；6酶切处理：将步骤5得到的片段化dsDNA经核酸酶S1Nuclease特异性降解单链DNA或RNA以及双链核酸中的单链部分后，再经核酸外切酶ExonucleaseI特异性分解单链DNA，酶切完成得到酶切产物；7dsDNA浓缩：对上述得到的酶切产物进行dsDNA检测，使得到dsDNA抗原浓度在0.5mgml-3mgml之间，若浓度不达标，以真空离心浓缩仪进行浓缩处理，65℃条件下，真空离心浓缩45min，使500μLDNA浓缩为300μL；8dsDNA回收：将酶切产物加入到10倍体积75％乙醇中混匀，-20℃条件下存放60min；13000rpm离心10min后弃上清后并用10倍体积75％冰乙醇洗沉淀一次，13000rmin离心2min，弃上清后13000rmin离心30s，用枪头吸去液体部分，放于室温5min，乙醇挥发完毕后加入500μL缓冲液，缓冲液为0.001MEDTA，0.01MPBS，pH7.4，溶解沉淀。

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权利要求：

百度查询： 安徽梅赛泰生物科技有限公司 一种dsDNA抗原的制备方法

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