申请/专利权人：苏州依科赛生物科技股份有限公司;上海吉泰依科赛生物科技有限公司

申请日：2023-09-18

公开（公告）日：2023-12-08

公开（公告）号：CN117187069A

主分类号：C12N1/06

分类号：C12N1/06;C07K1/34;C07K16/12;C07K16/06;G01N33/68;C12R1/19

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2023.12.26#实质审查的生效;2023.12.08#公开

摘要：本发明提供一种碱裂解工艺的大肠杆菌HCP检测方法，包括制备碱裂解生产工艺的大肠杆菌HCP抗原，免疫动物获得针对大肠杆菌HCP的多克隆抗体和建立适用于大肠杆菌HCP检测的ELISA检测方法。运用以上方案建立的检测方法可以检测碱裂解工艺提取的质粒中间品、原液及终产品的大肠杆菌HCP残留量。验证结果显示抗大肠杆菌HCP特异性多克隆抗体覆盖率高，并且不会与CHO、293、Vero等宿主细胞蛋白产生交叉反应，灵敏度可达0.4ngmL，因此该方法实现了高灵敏度和特异性的大肠杆菌HCP残留检测，使质粒载体生产符合GMP和临床应用的要求。

主权项：1.一种碱裂解工艺的大肠杆菌HCP检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.碱裂解工艺的大肠杆菌HCP的制备，S11.培养大肠杆菌获得菌体，S12.将步骤S11获得的菌体进行碱裂解，具体裂解过程如下，P1溶液：50mM葡萄糖，25mMTris-Cl，10mMEDTA，pH8.0重悬步骤S11获得的菌体，P2溶液：0.2MNaOH，1%SDS，pH12.5裂解P1溶液产物，P3溶液：3M醋酸钾，5M醋酸沉淀P2溶液产物，收集P3溶液上清液作为碱裂解产物，S13.将步骤S12中的碱裂解产物进行超滤浓缩，制得大肠杆菌HCP抗原；S2.制备兔抗大肠杆菌HCP抗体，S21.第0天采用弗氏完全佐剂初次免疫新西兰白兔，大肠杆菌HCP抗原为5mg，S22.第14284256天采用弗氏不完全佐剂免疫新西兰白兔，大肠杆菌HCP抗原为2.5mg，S23.第63天采血离心，收集抗血清纯化，制得兔抗大肠杆菌HCP抗体；S3.抗大肠杆菌HCP抗体生物素标记，使用NHS-dPEG12-生物素，对步骤S2中制备的兔抗大肠杆菌HCP抗体进行生物素标记，制备兔抗大肠杆菌HCP生物素化抗体；S4.大肠杆菌HCPELISA检测方法建立，S41.包被：将步骤S23中纯化的兔抗大肠杆菌HCP抗体用pH7.4、0.01MPBS缓冲液，稀释成1μgmL~8μgmL进行包被，每孔加100μL，然后用封板膜封口，置于4℃包被过夜，S42.封闭：甩干除去包被液，300μL由1×PBS+0.05%Tween20组成的洗涤液洗涤一次，每孔加入300μL由1%BSA+PBS组成的封闭液，室温孵育2小时，甩干除去封闭液，过夜吹干，S43.结合抗原：将由步骤S13制得的大肠杆菌HCP抗原作为校准品和待测样本分别加入相应孔中，100μL孔，用封板胶纸封住反应孔，37℃振荡孵育60分钟，S44.检测抗体孵育：倾倒掉步骤S43中的板孔溶液，用洗涤液清洗后，加入用稀释缓冲液以1：10000~20000稀释的5.6mgmL生物素化兔抗大肠杆菌HCP抗体进行结合，50μL孔，37℃振荡孵育1小时，S45.倾倒掉步骤S4中的板孔溶液，用洗涤液清洗后，向每孔加入100μL用稀释缓冲液以1:46000稀释的1mgmL链霉亲和素标记辣根过氧化物酶，37℃振荡孵育1小时，S46.加入TMB显色底物100μL孔，25℃避光孵育15分钟，S47.每孔加入100μL1MHCl终止液，终止反应，并用酶标比色仪测定OD450值，S48.以大肠杆菌HCP校准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，用四参数拟合方程绘制校准曲线，根据校准曲线和待测样本的OD计算待测样本浓度。

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