申请/专利权人：中国水产科学研究院黑龙江水产研究所

申请日：2021-10-12

公开（公告）日：2024-05-03

公开（公告）号：CN114002345B

主分类号：G01N30/02

分类号：G01N30/02;G01N30/06;G01N30/72;G01N30/86

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.05.03#授权;2022.05.24#实质审查的生效;2022.02.01#公开

摘要：本发明公开了一种鱼类鳃代谢组学样品前处理优化方法，涉及代谢组学技术领域；它的优化方法如下：步骤一：准备仪器与试剂；步骤二：UPLC‑Q‑TOFMS数据采集与分析：样品的采集与制备；UPLC‑Q‑TOFMS分析；数据处理和统计分析；本发明采用UPLC‑Q‑TOFMS技术，研究对象为非靶向代谢组学鱼鳃组织样品，对前处理方法中涉及到的液相提取净化方法，进行了优化及方法学考察，基于覆盖率（检测到的潜在代谢物的数量）、稳定性（代谢物相对峰面积和保留时间的RSD）进行了分析讨论，同时利用QC样品开展了方法学考察，最终建立了适用于鱼鳃组织的UPLC‑Q‑TOFMS非靶向代谢组学样品前处理方法。

主权项：1.一种鱼类鳃代谢组学样品前处理优化方法，其特征在于：它的优化方法如下：步骤一：准备仪器与试剂：AcquityUPLC系统；色谱柱；SCIEXTripleTOF5600+高分辨质谱仪；AllegraX-30R高速离心机；组织研磨机；涡旋混匀器；KQ300DB型数控超声仪；XS205DY电子天平；Milli-QA10超纯水机；200μL、1000μL、5000μL移液器；甲醇、乙腈；甲醇、甲酸；麻醉剂；生理盐水；液氮；数据处理软件系统：ProgensisQI；MicrsoftOfficeExcel；GraphPadPrism8.0；步骤二：UPLC-Q-TOFMS数据采集与分析：2.1、样品的采集与制备：实验前，实验鱼在室内控温循环养殖设备中暂养1周，实验用水为过滤、曝气72h的自来水，水温为24±1℃，每天保持12-14h的光照条件，遵照三定三巡的模式管理；采样前24h停止喂食，将鱼转移至含有40mgL麻醉剂溶液中，深度麻醉后置于冰上解剖，快速取出鳃组织，用无菌生理盐水润洗，吸水纸擦干后用液氮速冻，再转移至-80°C冰箱保存待测；取出-80℃保存的鳃组织样品于4℃解冻，准确称重30mg，加入480μL甲醇和5个钢珠，用组织研磨机60Hz研磨30s，冰水浴超声处理10min，4℃下13000rpm离心15min，取300μL的上层溶液，过0.22μm有机相滤膜至进样瓶中待测；同时，将所有鳃组织等量混合，采用经优化后的鳃组织前处理方法制备QC样品，用于方法学考察；2.2、UPLC-Q-TOFMS分析：色谱分离过程在AcquityUPLC系统上进行，色谱柱为WatersAcquityUPLCBEHC18，预柱为AcquityUPLCBEHC18VanGuardPre-Column；液相条件：柱温为40℃，自动进样器温度为4℃；正离子扫描：流动相A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈；负离子扫描：流动相A为水，B为乙腈；梯度洗脱：0～4min，95%～30%A；4～11min，30%～15%A；11～12min，15%～0%A；12～13min，0%A；13～13.2min，0%～95%A；13.2～15min，95%A，流速设为0.3mLmin；质谱条件：在正负离子模式下扫描数据，正负离子源电压为5500V-4500V，离子源温度为550℃，裂解电压为80V-80V，碰撞能量为35eV-35eV，碰撞能量扩展为15eV；氮气用作雾化气体和辅助气体，Gas1和Gas2的压力为55PSI，气帘气压力为35PSI；开启动态背景扣除，并设置IDA响应值超过100cps的8个峰用于二次质谱扫描；一级质谱的母离子和子离子扫描范围为50-1500Da，进样量10μL；2.3、数据处理和统计分析：将UPLC-Q-TOFMS获得的原始数据导入ProgensisQI软件，以完成峰对齐、峰识别、滤噪、峰匹配等数据预处理，使用峰面积对原始数据进行归一化处理，并输出由保留时间、精确质核比、样品名称及峰强度等信息组成的二维矩阵数据；使用MicrsoftOfficeExcel、GraphPadPrism8.0软件对各预处理方法获得的数据结果进行统计分析。

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