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申请/专利权人：江苏大学
申请日：2024-04-07
公开（公告）日：2024-06-07
公开（公告）号：CN118147186A
主分类号：C12N15/70
分类号：C12N15/70;C12N9/52;C12N15/57;C12R1/19
优先权：
专利状态码：在审-公开
法律状态：2024.06.07#公开
摘要：本发明属于基因工程领域，涉及一种广盐性嗜盐古菌蛋白酶C端延伸突变体的制备方法及其应用；步骤为：以嗜盐古菌的基因组为模板，通过OverlapPCR技术获得HlyAHap与HlyBHap的CTE融合表达蛋白的编码基因hlyAHap‑hlyBHapCTE，记为hlyAHap‑CTE，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。然后将hlyAHap‑CTE连接到载体上构建重组质粒，并将其转化原核宿主，诱导表达后对其进行镍亲和层析纯化和透析复性，孵育后得到嗜盐古菌蛋白酶C端延伸突变体，记为HlyAHap‑CTE。本发明得到了稳定性良好的广盐性蛋白酶，可以作为生物催化剂广泛应用于食品、医药、化工等工业领域。
主权项：1.一种广盐性的嗜盐古菌蛋白酶C端延伸突变体的制备方法，其特征在于具体步骤如下：首先基于嗜盐古菌Haladaptatuspaucihalophilus的基因组获得胞外蛋白酶编码基因序列，进一步设计含有酶切位点的目的片段引物，通过OverlapPCR技术获得目的片段，记为hlyAHap-CTE，核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；然后利用分子克隆技术将hlyAHap-CTE连接到载体上构建重组质粒，记为pET28a-hlyAHap-CTE；2重组质粒转化原核生物宿主，诱导表达：将步骤1重组质粒pET28a-hlyAHap-CTE，转化原核生物宿主，转化后的宿主细胞在添加IPTG诱导剂的LB培养基中进行一段时间的诱导表达，诱导表达后离心收集菌体；3嗜盐古菌蛋白酶HlyAHap-CTE的纯化与复性：将步骤2收集的菌体于细胞裂解液中进行重悬，超声破碎，然后离心收集上清液，采用镍柱亲和层析纯化，经纯化后再进行透析复性，最后在水浴条件下进行孵育，经孵育后得到嗜盐古菌胞外蛋白酶C端延伸突变体，记为HlyAHap-CTE；其氨基酸序列如SEQIDNo.4所示。
全文数据：
权利要求：
百度查询： 江苏大学 一种广盐性的嗜盐古菌蛋白酶C端延伸突变体的制备方法及其应用
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