申请/专利权人：云南农业大学

申请日：2024-03-21

公开（公告）日：2024-06-07

公开（公告）号：CN118147220A

主分类号：C12N15/84

分类号：C12N15/84;C12N15/65;A01H4/00;A01H5/00;A01H6/46

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2024.06.25#实质审查的生效;2024.06.07#公开

摘要：本发明公开了一种农杆菌介导的甘蔗复合体蔗茅的遗传转化方法，属于植物组织培养和遗传转化技术领域，本发明通过农杆菌介导转化，开发了甘蔗复合体二倍体蔗茅的遗传转化体系，通过优化蔗茅的愈伤组织诱导培养基，提高蔗茅愈伤组织的胚性；通过真空渗透，强化蔗茅愈伤组织的浸染力度；通过愈伤组织的恢复培养和继代筛选培养，增加了转化效率；使用本发明的遗传转化方法，转化70‑90块蔗茅胚性愈伤组织，能得到10‑14个转基因株系，转化效率高达到14.21％。本发明首次构建了蔗茅的遗传转化体系，为进一步将蔗茅开发成为甘蔗复合体的模式植物奠定了基础，为开展甘蔗复合体功能基因研究提供了技术支撑。

主权项：1.一种农杆菌介导的甘蔗复合体蔗茅的遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，将蔗茅的幼嫩心叶接种至愈伤组织诱导培养基CIM中培养，将培养获得的愈伤组织再次转移到CIM培养基中，进行继代培养，获得胚性愈伤组织；步骤2，选择携带抗除草剂Bar基因标记或者抗潮霉素hpt基因标记的植物表达载体，将所述植物表达载体转化农杆菌感受态细胞，筛选携带所述植物表达载体的阳性菌落，即为工程菌；步骤3，将工程菌接种于YEP培养基，扩大培养、离心收集菌体，并使用重悬液RS悬浮，制备含有工程菌的浸染液；步骤4，将步骤1获得的胚性愈伤组织转移至含有工程菌的浸染液中培养，之后进行真空抽滤、震荡培养，将培养后的愈伤组织转移至愈伤组织共培养基CCM中，进行共培养；共培养结束后，将愈伤组织转移至恢复培养基CRM中，进行恢复培养；步骤5，将恢复培养结束后的愈伤组织转移到愈伤组织继代筛选培养基CRSM中进行继代筛选培养，筛选获得抗性愈伤组织；将抗性愈伤组织转移到愈伤组织分化筛选培养基CDSM上进行分化筛选培养，得到抗性芽；步骤6，抗性芽经生根、PCR鉴定后，得到阳性转基因苗；其中，所述愈伤组织诱导培养基CIM包括以下浓度组分：MS+蔗糖25-30gL+甘蔗维生素1-2mL+椰子水25-50mL+水解络蛋白0.3-0.5gL+柠檬酸0.15-0.2gL+半胱氨酸0.03-0.05gL+肌醇0.1-0.2gL+2,4-D2-3mgL+硝酸银1-2mgL+植物凝胶3-5gL；所述YEP培养基包括以下浓度组分：酵母粉10gL+牛肉膏10gL+NaCl5gL+卡那霉素50mgL+利福平50mgL；所述重悬液RS包括以下浓度组分：12MS+葡萄糖2-5gL+麦芽糖2-5gL+乙酰丁香酮100-200μM；所述愈伤组织共培养基CCM包括以下浓度组分：MS+蔗糖25-30gL+甘蔗维生素1-2mL+椰子水25-50mL+水解络蛋白0.3-0.5gL+柠檬酸0.15-0.2gL+半胱氨酸0.03-0.05gL+肌醇0.1-0.2gL+2,4-D2-3mgL+硝酸银1-2mgL+乙酰丁香酮100-200μM+植物凝胶3-5gL；所述恢复培养基CRM培养基包括以下浓度组分：MS+蔗糖25-30gL+甘蔗维生素1-2mL+椰子水25-50mL+水解络蛋白0.3-0.5gL+柠檬酸0.15-0.2gL+半胱氨酸0.03-0.05gL+肌醇0.1-0.2gL+2,4-D2-3mgL+硝酸银1-2mgL+植物凝胶3-5gL+头孢霉素300-400mgL；所述愈伤组织继代筛选培养基CRSM培养基包括以下浓度组分：MS+蔗糖25-30gL+甘蔗维生素1-2mL+椰子水25-50mL+水解络蛋白0.3-0.5gL+柠檬酸0.15-0.2gL+半胱氨酸0.03-0.05gL+肌醇0.1-0.2gL+2,4-D2-3mgL+硝酸银1-2mgL+植物凝胶3-5gL+头孢霉素300-400mgL+除草剂basta2-3mgL或潮霉素25-30mgL；所述愈伤组织分化筛选培养基CDSM包括以下浓度组分：MS+蔗糖25-30gL+甘蔗维生素1-2mL+椰子水25-50mL+柠檬酸0.15-0.2gL+半胱氨酸0.03-0.05gL+肌醇0.1-0.2gL+6-BA1-2mgL+植物凝胶3-5gL+头孢霉素300-400mgL+除草剂basta2-3mgL或潮霉素25-30mgL；所述甘蔗维生素包含：1g维生素B1、0.5g维生素B6、0.5g烟酸、2g甘氨酸、50g精氨酸和1L水。

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