申请/专利权人：东北林业大学

申请日：2024-03-29

公开（公告）日：2024-06-07

公开（公告）号：CN118147184A

主分类号：C12N15/70

分类号：C12N15/70;C12N1/21;C12N15/53;C12P17/18;C12R1/19

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2024.06.25#实质审查的生效;2024.06.07#公开

摘要：产7‑甲基黄嘌呤基因工程菌株的构建方法及其应用，涉及产7‑甲基黄嘌呤基因工程菌株的构建方法及其应用。本发明通过搭建并优化咖啡因去甲基化基因通路并对咖啡因去甲基化酶还原酶的优化以及合成工艺优化增强其降解咖啡因生产7‑甲基黄嘌呤的能力；同时搭建辅因子循环模块消除咖啡因去甲基化过程中产生的甲醛并提供还原力，进一步提高大肠杆菌的7‑甲基黄嘌呤生产能力并消除潜在的污染物甲醛。通过对高密度发酵和全细胞转化工艺的优化，使7‑甲基黄嘌呤产量达到6.81L，是目前国外内合成7‑甲基黄嘌呤的最高产量。本发明可获得产7‑甲基黄嘌呤基因工程菌株的构建方法及其应用。

主权项：1.产7-甲基黄嘌呤基因工程菌株的构建方法，其特征在于该构建方法按以下步骤进行：步骤一、构建咖啡因N-去甲基化酶表达途径以及优化：①将载体pYB1s-GFP使用XhoI和BglII双酶切，电泳回收3500bp片段；使用Gibson连接方法，分别将咖啡因去甲基化酶编码基因ndmA、ndmB和ndmD片段连接至载体pYB1s-GFP上；取10μL连接产物转化DH5α，使用链霉素抗性平板筛选，挑取阳性克隆并进行培养，提取得到重组载体pYB1s-ndmABD；②以步骤①中的重组载体pYB1s-ndmABD为模板，使用引物ndmA2-F和ndmA2-R扩增，获得ndmA片段；使用引物ndmB2-F和ndmB2-R扩增，获得ndmB片段；使用引物ndmD2-F和ndmD2-R扩增，获得ndmD片段；以pY97a-kivd-par-tyrb质粒为模板，使用引物p107-F和p107-R扩增，获得LacO-p107片段；以pYB1s-eGFP质粒为模板，使用引物pYB1s1-F和pYB1s1-R扩增，获得pYB1s线性化载体；③使用goldengate连接方法，将步骤②中的pYB1s线性化载体、ndmD片段、LacO-p107片段、ndmB片段和ndmA片段加入到goldengate反应体系中进行连接反应；取10μL连接产物转化DH5α，使用链霉素抗性平板筛选，挑取阳性克隆并进行培养，提取得到重组载体pYB1s-ndmD-LacO-p107-ndmBA；以pYB1s-ndmD-LacO-p107-ndmBA作为模板，使用引物ndmDt-F和ndmD2-R扩增，得到ndmDt片段；使用goldengate连接方法，将步骤②中的pYB1s线性化载体、ndmDt片段、LacO-p107片段、ndmB片段和ndmA片段加入到goldengate反应体系中进行反应；取10μL连接产物转化DH5α，使用链霉素抗性平板筛选，挑取阳性克隆并进行培养，提取得到重组载体pYB1s-ndmDt-LacO-p107-ndmBA；步骤二、搭建辅因子循环模块：1将载体pSB1c-GFP使用XhoI和BglII双酶切，电泳回收3500bp片段；使用Gibson连接方法，将甲醛脱氢酶编码基因frmA、frmB和甲酸脱氢酶编码基因FDH片段加入到Gibson反应体系中反应；取10μL连接产物转化DH5α，使用氯霉素抗性平板筛选，挑取阳性克隆并进行培养，提取得到重组载体pSB1c-frmAB-FDH；2将步骤1中的重组载体pSB1c-frmAB-FDH与步骤③中的pYB1s-ndmDt-LacO-p107-ndmBA共同转入大肠杆菌BW25113中，得到基因工程菌BW25113pYB1s-ndmDt-LacO-p107-ndmBA+pSB1c-frmAB-FDH。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 东北林业大学 产7-甲基黄嘌呤基因工程菌株的构建方法及其应用

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