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申请/专利权人：北京大学
申请日：2021-06-18
公开（公告）日：2024-06-18
公开（公告）号：CN115494031B
主分类号：G01N21/64
分类号：G01N21/64
优先权：
专利状态码：有效-授权
法律状态：2024.06.18#授权;2023.01.03#实质审查的生效;2022.12.20#公开
摘要：本发明公开了一种基于CRISPRdCas9系统与寡核苷酸探针的活细胞DNA标记信号放大方法，通过增加单个sgRNA所携带的有机染料数目对现有的CRISPRMB平台进行改造，运用分子合成技术在sgRNA的stem‑loop2区域插入串联重复多次的TS序列，对应多组能够发生FRET的供体MB和受体MB，从而在不增加用于标记单个DNA位点的dCas9‑sgRNA复合体数目的同时实现了有效的信号强度放大，为基于CRISPRdCas9系统与寡核苷酸探针的活细胞DNA标记方法提供一种通用的信号放大方法。
主权项：1.一种基于CRISPRdCas9系统与寡核苷酸探针的活细胞DNA标记信号放大方法，包括：1构建靶向目标DNA位点的sgRNA表达片段，所述sgRNA表达片段在sgRNA的stem-loop2区域插入串联重复多次的TS序列，所述TS序列由能够被探针A识别的3’端序列TSa和能够被探针B识别的5’端序列TSb组成；2构建能够发生FRET的供体MB和受体MB：合成序列与TSa特异性互补的寡核苷酸探针A和序列与TSb特异性互补的寡核苷酸探针B，在探针A的3’端连接供体荧光团或受体荧光团，对应地在探针B的5’端连接受体荧光团或供体荧光团；带有供体荧光团的探针为供体MB，带有受体荧光团的探针为受体MB，即探针A作为供体MB时，探针B作为受体MB，而探针A作为受体MB时，探针B作为供体MB；3将步骤1构建的sgRNA表达片段与dCas9蛋白表达片段克隆到质粒表达载体中，并将该质粒表达载体转染到活细胞中；4将步骤2构建的供体MB和受体MB通过电转的方式共同导入步骤3转染后的活细胞中；5对电转后的活细胞进行荧光显微镜成像，得到放大的目标DNA位点的荧光信号强度。
全文数据：
权利要求：
百度查询： 北京大学 一种基于CRISPR/dCas9系统与寡核苷酸探针的活细胞DNA标记信号放大方法
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