申请/专利权人：因诺伟(北京)生物医疗科技有限公司

申请日：2021-11-09

公开（公告）日：2024-06-18

公开（公告）号：CN114149970B

主分类号：C12N5/0784

分类号：C12N5/0784;C12N5/0789;C12N5/09

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.06.18#授权;2022.03.25#实质审查的生效;2022.03.08#公开

摘要：本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种外周血造血干细胞来源致敏树突状细胞的制备方法及应用，其中促DC成熟期采用下述原料：TNF‑ɑ、IL‑6、PGE‑2、IL‑1β；本发明涉及的DC培养方法，能够大大缩短培养时间，获得高质量的DC细胞，适合与其同来源CTL细胞的培养周期，采用WT1阳性的肿瘤细胞外泌体负载DC，可满足体外扩增培养CTL细胞所需要的刺激且达到更好的抗肿瘤效果。

主权项：1.一种外周血造血干细胞来源致敏树突状细胞的制备方法，所述方法为非疾病治疗方法，其特征在于：所述制备方法包括标本来源HLA-A*0201阳性的健康供者外周血造血干细胞采集物；⑴外周血造血干细胞采集物单个核细胞分离取三管50ml离心管，分别加入30mlFicoll淋巴细胞分离液，每管分别上覆20ml新鲜外周血造血干细胞采集物，1700rpm×25min离心，轻轻将白膜层转移到另外2支离心管中，10mlPBS漂洗，1500rpm×5min，去除上清，重复上述步骤1次；2WT1阳性肿瘤细胞外泌体的制备：a复苏WT基因高表达的慢性髓性白血病细胞系NB4细胞，置于含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中，37℃，5％CO2培养至80-90％融合；b取6只干净的15mL离心管，每管中用移液管加入13mL留取的NB4细胞上清，4℃水平离心300g×10min；c取6只超离管，缓慢吸取15mL离心管中的上清转移至超离管中，弃去底部沉淀，每只离心管中含有10mL的液体，用PBS缓冲液配平，于超速离心机中4℃水平离心2000g×10min；d另取6只超离管，缓慢吸取步骤c中的液体转移至新的超离管中，弃去底部沉淀，保持每只离心管中所含液体体积在10mL，PBS缓冲液配平，于超速离心机中4℃水平离心10000g×30min；e另取6只超离管，余下步骤与c相同，放入超速离心机后调整转速为100000g×2h；f弃去上清，用PBS缓冲液重悬6只超离管内沉淀，配平后置于超速离心机中4℃水平离心100000g×1h；g弃去上清，用移液枪取20μl外泌体悬滴加在铜网上，室温条件静置1min后将铜网上多余液体用滤纸从侧面吸干，在铜网上滴加2％的磷酸钨酸30μl进行负染，1min后将磷钨酸用滤纸吸干，室温静置10min后在透射电镜下观察其形态；在WT1+NB4细胞的培养上清中能够提取到外泌体，观察NB4细胞外泌体在电镜下的形态，可见其呈类圆形或杯状，大小不均一，直径在30～150nm；h采用Westernblot检测NB4细胞外泌体蛋白组分，采用Westernblotting检测NB4细胞来源的外泌体中的WT1蛋白组分，证实外泌体中有WT1蛋白存在；3DC细胞分离与培养RPMI-1640培养基+10％的灭活人AB血清重悬，混匀后移入在75cm2培养瓶中，5％的CO2，37℃培养箱中2-4小时；吸出悬浮细胞，贴壁细胞中加入DC基础培养基含AIM-V培养液15ml，10％的人AB血清，IL-4100ngml,GM-CSF80ngml，37℃培养箱培养24小时；4促DC成熟在上述基础培养基基础上加入TNF-ɑ10ngml、IL-61000Uml、PGE-21μgml、IL-1β10ngml，继续培养24小时后，采用WT1肿瘤细胞外泌体刺激，相同条件下孵育40min，即得致敏树突状细胞。

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