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申请/专利权人：北京理工大学;北京理工大学唐山研究院

摘要：本发明提供了一种高通量筛选sgRNA骨架sgRNAscaffold活性突变体序列的系统和方法，属于生物工程技术领域。所述体系包含Cas蛋白表达载体和sgRNA骨架突变体筛选载体；所述Cas蛋白表达载体上包含以下表达元件：Cas蛋白编码基因、质粒复制子、以及第一抗性筛选标签表达盒；所述sgRNA骨架突变体筛选载体包含以下表达元件：复制子、第二抗性筛选标签表达盒、第三筛选标记表达盒、用于表达sgRNA骨架序列的启动子和终止子。所述系统和方法可以应用于CRISPR基因编辑系统sgRNA骨架元件的筛选，利用本方法，能够得到序列多样的sgRNA骨架，进而应用于多靶点基因编辑、多基因转录调控、菌株库构建等领域，拓展CRISPR基因编辑系统的应用领域和编辑效率。

主权项：1.一种sgRNA骨架活性突变体筛选系统，其特征在于，所述系统包含Cas蛋白表达载体和sgRNA骨架突变体筛选载体；所述Cas蛋白表达载体上包含以下表达元件：Cas蛋白编码基因、质粒复制子、以及第一抗性筛选标签表达盒；所述sgRNA骨架突变体筛选载体包含以下表达元件：质粒复制子、第二抗性筛选标签表达盒、第三筛选标签表达盒、用于表达sgRNA骨架序列的启动子和终止子；所述第一抗性筛选标签表达盒包含第一抗性筛选标签，所述第一抗性筛选标签为抗性基因，包括但不限于氨苄青霉素，壮观霉素，氯霉素，卡那霉素，或四环素抗性基因；所述第二抗性筛选标签表达盒包含第二抗性筛选标签，所述第二抗性筛选标签是任意不同于Cas蛋白表达载体中的第一抗性基因的抗性基因；所述第三筛选标签表达盒包含第三筛选标记基因，所述第三筛选标记包括但不限于荧光信号标记，或颜色信号标记；所述第三筛选标记基因中加入一段插入序列使其失活，所述插入序列包含可被识别的23bp外源序列以及与第三筛选标签插入位点上游的同源序列；所述插入位点是指23bp外源序列在第三标筛选记基因上的插入位点，该位点是插入后能够使第三筛选标记基因失活的任意位点；所述23bp外源序列包含20bp识别序列和3bpPAM，所述识别序列是任意被CRISPRCas9高效识别的外源序列；所述PAM为原间隔序列临近基序。

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