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申请/专利权人：瑞吉明(山东)生物科技有限公司

摘要：本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种多聚脱氧核糖核苷酸的制备方法及其应用。一种多聚脱氧核糖核苷酸的制备方法，包括以下步骤：将DNA原料酶解并离心，上清液加入磷酸盐缓冲液中，超声处理后分离与纯化，纯化液透析脱盐后低温冷冻干燥，得到的粉末进行脂质体封装和PEG表面修饰，得到多聚脱氧核糖核苷酸纳米胶囊，以便后续偶联靶向配体。本发明采用预功能化脂质体作为封装材料，制备得到的纳米胶囊具有抗降解能力，提升多聚脱氧核糖核苷酸在生物体内的留存与利用效率，通过精确控制封装过程，能够确保纳米胶囊的高效载药和结构稳定，PEG涂层表面化修饰以提高纳米胶囊的稳定性，同时保障纳米胶囊的生物相容性与安全性。

主权项：1.一种多聚脱氧核糖核苷酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：①预处理和提取：选取鱼类精巢DNA原料并破碎预处理，与酶组合溶液按体积比1:5-20混合均匀，控制酶解条件，进行酶解反应；所述酶组合溶液为蛋白酶和胰脂肪酶按1-2:1混合，其中蛋白酶为胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶且按1:1配比；所述酶解反应温度45-50℃，pH为7.5-8，酶解时间2-4h；达到设定时间后，迅速升温至60-70℃保持5-10分钟或加入1mMEDTA或1-5mM焦磷酸盐作为抑制剂终止酶活性，离心或过滤分离固液，取上清液；将上清液转移到含有磷酸盐缓冲溶液的容器中，室温下搅拌至充分混匀，4-10℃低温下超声波处理，得到提取液；②分离和纯化：通过高速离心和滤膜过滤初步除杂，选用离子交换柱梯度洗脱，随后使用凝胶过滤层析柱分离，得到分离液；使用透析或超滤去除小分子杂质，最后通过高效液相色谱纯化得纯化液；③脱盐与干燥：选用生物可降解材料基质的脱盐膜，选用分子截留量高于多聚脱氧核糖核苷酸分子量的透析袋，使用pH为7.4的磷酸盐缓冲液作为透析液，将纯化液脱盐得脱盐液；按脱盐液总量的5%添加保护剂，于-40-（-20）℃预冻，再进行低温冷冻干燥，得多聚脱氧核糖核苷酸粉末；④封装和表面修饰：选用预功能化脂质体作为封装材料，溶解后旋转蒸发或喷雾干燥法去除溶剂，形成的脂质体薄膜迅速分散于缓冲溶液中，快速搅拌自组装成纳米粒子悬浮液；使用微流控技术或滴加法，将多聚脱氧核糖核苷酸粉末缓慢加入到预形成的纳米粒子悬浮液中，温和搅拌促进包封，利用多聚脱氧核糖核苷酸与脂质体的静电吸附和疏水作用进行装载；向纳米粒子悬浮液中加入磷脂-聚乙二醇共轭物，温和搅拌确保磷脂-聚乙二醇共轭物均匀分布并附着于纳米粒子表面，形成PEG涂层，采用透析或离心超滤，清除体系中的杂质，得到纯净的多聚脱氧核糖核苷酸纳米胶囊；在纳米胶囊表面修饰完成后，依据特定递送需求，选择马来酰亚胺-聚乙二醇-活性酯作为生物偶联剂将预先选定的靶向配体共价连接到纳米粒子表面的预置活性基团上。

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