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申请/专利权人：诸城市浩天生物科技有限公司

摘要：本发明公开了一种突变体表达菌株及D‑阿洛糖的合成方法，涉及生物技术领域，通过表达菌株构建，得168：：pP43NMK‑LRI，然后对了E53、H94、A142、E273这四个位点进行位点突变，得到的突变体E53D、H94A、A142G、E273D、H94AA142G、H94AA142GE53D、H94AA142GE53DE273D相对酶活力分别提高了1.2倍、1.85倍、1.18倍、1.4倍、2.1倍、2.5倍、2.73倍大大提高了D‑阿洛糖的转化效果。

主权项：1.一种突变体表达菌株的制备方法，其特征在于包括以下步骤：S1、表达菌株构建S1-01、引物F1：AACTGCAGATGTACCTGTATAACAAAGATR1：GGGGTACCTTATTTACGCAGGGACAGCACTS1-02、载体pP43NMK-LRI构建目的基因LRI获得2×高保真酶mix50μL，模板1μL，F12μL，R12μL，ddH2O补齐100μL，反应程序：98℃预变性2min；98℃变性20s，降温至退火温度55℃退火20s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保温，其后进行PCR产物纯化；双酶切体系及反应条件对质粒pP43NMK和目的基因LRI分别进行pstIkpnI双酶切，10*buffer5μL，BSA2μL，pstIkpnI22μL，DNA20μL，ddH2O19μL，共50μL，37℃酶切1h，回收目的载体片段约为7500bp，目的基因片段约为1200bp；T4DNA连接酶反应体系及条件载体DNA1μg，目的片段2μg，T4连接酶1μL，10×T4连接酶Buffer1μL，ddH2O补齐10μL，16℃连接2h；化学转化取10μL连接产物加入DH5α感受态细胞后，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴2min，加入600μL无抗LB液体培养基，37℃低速、160～180rpm下孵育60min，涂布于LBAmp100μgmL抗性平板；克隆菌株阳性克隆子筛选菌落PCR验证后，提质粒送华大基因测序验证，得载体pP43NMK-LRI；S1-03、表达菌株制备电转化取1μL测序正确的载体pP43NMK-LRI，加到表达菌株Bacillussubtilis168感受态中，混匀，加入到预冷的电击杯中，将电击杯插入电转化仪上，设置好电压2.5KV，电击，电击结束加入500μL无抗LB液体培养基，转移至1.5mLEP管中，37℃、180rpm孵育1h，涂布于LBAmp100μgmL抗性平板；表达菌株阳性克隆子筛选LB抗性平板上的菌落PCR验证后，进行表达转化验证，将验证后的菌命名为168：：pP43NMK-LRI，保存在-80℃冰箱；S2、突变体表达菌株制备S2-01、突变位点筛选通过AlphaFold进行位点预测，LRI预测到的关键位点有E53、H94、A142、E273，氨基酸序列第53位谷氨酸突变为天冬氨酸，氨基酸序列第94位组氨酸突变为丙氨酸，氨基酸序列第142位丙氨酸突变为甘氨酸，氨基酸序列第273位谷氨酸突变为天冬氨酸；S2-02、引物 S2-03、突变PCR体系及程序5×PhusionHFbuffer2μL，dNTP2.5mmolL0.8μL，DNA模板0.2μL，FR各0.3μL，DMSO0.3μL，Phu高保真DNA聚合酶2UμL0.1μL，ddH2O6μL，总体积10μL；预变性：98℃变性3min；扩增循环：98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸4.5min，循环32次；补齐：72℃延伸10min；S2-04、DpnI消化模板体系10μL及反应条件10×buffer1μL，DNAPCR产物8μL，DpnI1μL；37℃、1h；S2-05、化学转化将PCR产物在37℃经DpnI消化模板质粒1h后，取10μL加入大肠杆菌DH5α感受态，冰浴30min，42℃水浴热激90s，冰上静置5min。加入600μLLB液体培养基，涂布于LBAmp100μgmL平板上，直至菌液被全部吸收，倒置平板，37℃培养12～16h，可见相应菌落；S2-06、克隆菌株阳性克隆子筛选提质粒送华大基因测序验证；S2-07、突变体及组合突变体质粒获得E53D：使用E53D引物，pP43NMK-LRI为模板，按照步骤S2-03～S2-06进行培养，得到E53D突变质粒，为质粒1；H94A：使用H94A引物，pP43NMK-LRI为模板，按照步骤S2-03～S2-06进行培养，得到H94A突变质粒，为质粒2；A142G：使用A142G引物，pP43NMK-LRI为模板，按照步骤S2-03～S2-06进行培养，得到A142G突变质粒，为质粒3；E273D：使用E273D引物，pP43NMK-LRI为模板，按照步骤S2-03～S2-06进行培养，得到E273D突变质粒，为质粒4；H94AA142G：使用A142G引物，质粒2为模板，按照步骤S2-03～S2-06进行培养，得到H94AA142G突变质粒，为质粒5；H94AA142GE53D：使用E53D引物，质粒5为模板，按照步骤S2-03～S2-06进行培养，得到H94AA142GE53D突变质粒，为质粒6；H94AA142GE53DE273D：使用E273D引物，质粒6为模板，按照步骤S2-03～S2-06进行培养，得到H94AA142GE53DE273D突变质粒，为质粒7；S2-08、突变体表达菌株制备将测序正确的突变体质粒1～7，分别电转化到表达菌株Bacillussubtilis168中，方法同步骤S1-03，转化成功的突变体表达菌株分别命名为168：：pP43NMK-LRI-E53D、168：：pP43NMK-LRI-H94A、168：：pP43NMK-LRI-A142G、168：：pP43NMK-LRI-E273D、168：：pP43NMK-LRI-H94AA142G、168：：pP43NMK-LRI-H94AA142GE53D、pP43NMK-LRI-H94AA142GE53DE273D，保藏在-80℃冰箱。

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