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申请/专利权人：扬州大学

摘要：本发明公开了一种杂交瘤细胞株的筛选方法，包括，通过聚乙二醇的方法进行细胞融合，分装在4块96孔板中；杂交瘤细胞检测前，先进行全换液，待其变黄后再进行ELISA检测；检测结果为阳性的杂交瘤细胞进行亚克隆时，仅分装在96孔细胞板中的2排，即24个小孔内，且不按照常规每孔1个细胞的方式进行亚克隆，而改为每孔1‑2个细胞；获得杂交瘤细胞株。本发明提供一种杂交瘤细胞株的筛选方法，在8个月时间获得了20多株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，筛选和制备单克隆的时间可缩短到原来的12‑23。

主权项：1.一种杂交瘤细胞株的筛选方法，其特征在于：包括，将脾细胞和骨髓瘤细胞混匀于50mL的灭菌离心管中，Eppendorf5810R高速冷冻离心机1000rmin离心5min；离心结束后，弃去上清，手掌轻拍离心管底，使细胞沉淀分散均匀，在40℃水浴中预热；匀速的转动离心管，并用无菌吸管吸取1mL40℃预热的PEG1500，向离心管中缓慢加入，时间控制在60s内；持续轻晃，遵循先慢后快的原则，在90s内滴加30mL40℃预热的DMEM基础培养基，以终止PEG的作用；37℃、5％CO2培养箱中静置10min，结束后，Eppendorf5810R高速冷冻离心机1000rmin离心10min，弃上清；加入30mLHAT培养基及备用的饲养细胞，轻轻重悬沉淀细胞后补HAT培养基至40mL；100μL孔，加入4块96孔细胞培养板中，5％CO2培养箱中培养；在5％CO2培养箱中培养5天后，用HAT培养基半换液，培养10天后，用HT培养基全换液，注意观察杂交瘤细胞的生长状态，待细胞上清变黄时弃去，再次换液细胞孔上清变黄后，吸取上清进行间接ELISA检测；检测结果为阳性的96孔板中的杂交瘤细胞，直接取一半96孔板中细胞，将其稀释至每毫升中含有10-20个细胞，按照每孔加入100微升的量；在检测两次阳性后立刻进行亚克隆，每个细胞孔中的细胞计数后仅分装在96孔细胞板中的2排，即24个小孔内，且不按照常规每孔1个、3个、10个细胞的方式进行亚克隆，改为每孔1-2个细胞，不加饲养细胞，同时为了保种，阳性孔扩增到24孔板中；获得杂交瘤细胞株；其中，筛选策略为分别筛选，在第一次检测后进行交叉特异性筛选，去除非特异性和交叉反应的杂交瘤细胞株；其中，亚克隆化过程中，在细胞亚克隆生长成团，128-256个细胞的时期，轻轻将单克隆的细胞团吹散，重新贴壁生长，3天后细胞可以铺满孔底。

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