申请/专利权人：云南师范大学

申请日：2019-03-13

公开（公告）日：2019-09-13

公开（公告）号：CN110229842A

主分类号：C12N15/81(20060101)

分类号：C12N15/81(20060101);C12N15/90(20060101);C12R1/84(20060101)

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2019.10.15#实质审查的生效;2019.09.13#公开

摘要：本发明公开了一种用于毕赤酵母的基因编辑载体pHS‑AVC‑LW1073。本发明构建的CRISPRCas9基因载体，包括复制起始位点、启动子、筛选标记基因、Cas9蛋白基因、核定位序列和gRNA编码的DNA。本发明构建的CRISPRCas9基因载体能够对毕赤酵母基因组进行有效的编辑包括基因或者DNA序列的敲除、置换、插入等操作，具有试验周期短、操作简洁和节省成本等优点。

主权项：1.一种用于毕赤酵母的基因编辑载体pHS-AVC-LW1073，其特征在于，所述的载体pHS-AVC-LW1073包括质粒pGAPZaA、sgRNA元件和Cas9元件，所述的sgRNA元件由sgRNA启动子、sgRNAbackbone和靶点插入酶切位点组成，所述的Cas9元件为编码基因Cas9的全长CDS序列并且N端加有核定位信号SV40NLS。

全文数据：一种用于毕赤酵母的基因编辑载体pHS-AVC-LW1073技术领域本发明属于基因工程技术领域，涉及一种用于毕赤酵母的基因编辑载体，具体为一种用于毕赤酵母的CRISPRCas9基因编辑载体pHS-AVC-LW1073。背景技术对基因进行定点编辑，是生物研究领域重要的方法之一。科学家们一直在寻找能对基因进行精确而快速的编辑方法，直至2013年发现了CRISPRCas9系统。CRISPRCas9系统是细菌和古细菌在不断进化的过程中产生的适应性的免疫防御机制，用来保护自身的基因组免受外源核酸如噬菌体、病毒等的干扰和破坏。CRISPRCas9系统作为一套适应性免疫系统，应用CRISPRRNAcrRNA以碱基互补的形式引导Cas蛋白识别入侵的外源基因组，并对其DNA进行剪切。与先前的ZFN和TALEN等技术相比，CRISPRCas9系统能更好地识别靶基因，且CRISPRCas9系统由crRNA和Cas9蛋白组成，结构简单，仅需构建一对引物。因此该基因编辑技术具有更高的编辑效率、更简单的操作、成本低、编辑范围广等优势。毕赤酵母作为一种表达外源基因的宿主菌，既具有操作简单，生长快等特点，又具有真核细胞的翻译后修饰加工系统。在表达某些基因工程产品时，可以大规模生产，从而有效地降低成本。但是至今对毕赤酵母基因组仍然缺乏简单有效的编辑方法，从而限制了对毕赤酵母工程菌株的改造。发明内容本发明的目的在于提供一种用于毕赤酵母的CRISPRCas9基因编辑载体pHS-AVC-LW1073，本发明构建了毕赤酵母的CRISPRCas9基因编辑载体，利用设计gRNA，可以定向得插入到把位点来实现毕赤酵母本身特定基因的敲除、插入和替换，为CRISPRCas9基因编辑技术在毕赤酵母中的应用奠定了坚实基础。本发明具体通过以下技术方案实现：一种用于毕赤酵母的基因编辑载体pHS-AVC-LW1073，所述的载体pHS-AVC-LW1073包括质粒pGAPZaA、sgRNA元件和Cas9元件，所述的sgRNA元件由sgRNA启动子、sgRNAbackbone和靶点插入酶切位点组成，所述的Cas9元件为编码基因Cas9的全长CDS序列并且N端加有核定位信号SV40NLS。所述的载体pHS-AVC-LW1073的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。所述的gRNA元件具体区域为SEQIDNO.1所示序列的第6904-7274的核苷酸序列。所述的sgRNA启动子为pSNR52Ⅲ类启动子，具体为SEQIDNO.1所示序列的第6094-7172的核苷酸序列。所述的sgRNA识别受体菌的目的DNA，所述受体菌的目的DNA具有5’-NX-NGG-3’结构，即为一个PAM，NX表示X个N，N为A、G、C或T，X可为大于5的一个自然数。所述的靶点插入酶切位点为AarI，酶切位点信息为：5'...CACCTGCN4↓...3'；3'...GTGGACGN8↑...5'。所述的Cas9元件具体区域为SEQIDNO.1的第2176-8619的核苷酸序列。所述的载体pHS-AVC-LW1073序列SEQIDNo.1的第735-1109位的核苷酸序列为博来霉素抗性基因。本发明的有益效果为：本发明成功构建了能够用于毕赤酵母的基因编辑系统，能对毕赤酵母的基因组进行编辑包括基因或DNA序列的敲除、置换、插入等操作，具有试验周期短、操作简洁和节省成本等优点。该方法成功用于报告基因mcherry的敲除，为本发明在其他方面的应用提供了一个有效参考。附图说明图1是本发明一种毕赤酵母CRISPRCas9基因编辑载体的结构示意图；图2是mcherry基因敲除前后的测序结果；其中上为敲除前，下为敲除后；Cas9识别位点由绿色标出；图3是mcherry在荧光显微镜下的检测结果；其中左图为敲除前，右图为敲除后。具体实施方式下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实验材料和试剂：实验菌株和载体：表达宿主菌：GS115均购于Invitrogen公司。实验仪器：离心机Eppendorf；PCR扩增仪Bio-Rad；核酸电泳仪Bio-Rad；蛋白电泳仪AmershamBioscience；凝胶成像仪Bio-Rad；倒置荧光显微镜AxioObser。主要培养基:YPD、LB、酵母发酵培养基FA与FB均按照“Invitrogen公司操作手册”的推荐方法来配制。实施例1pHS-AVC-LW1073的构建一种用于毕赤酵母的基因编辑载体pHS-AVC-LW1073的构建方法，包括以下步骤：1以质粒pGAPZaA为模版，获得载体骨架Frag1，包括博莱霉素筛选基因及毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子GAPpromoter和复制起点；2人工合成来源于酿脓链球菌的Spcas9基因及NLS核定位信号，为Frag2；3人工合成gRNA-sgRNA_backbone及其启动子pSNR52，为得载体骨架Frag34按照Frag1、Frag2、Frag3的顺序连接3个片段，获得质粒pHS-AVC-LW1073；5根据毕赤酵母的基因序列设计用于特异性靶向基因的sgRNA，再在靶向基因sgRNA的基础上设计sgRNA双链寡聚核苷酸序列，进行化学合成；6PCR反应，使得用于特异性靶向基因的sgRNA成为有粘性末端的DNA序列，获得Frag4；7酶切质粒pHS-AVC-LW1073，与Frag4连接，获得敲除质粒。基因编辑载体pHS-AVC-LW1073的结构如图1所示。上述毕赤酵母CRISPRCas9基因编辑载体的构建方法中，限制性核酸内切酶为AarI；限制性核酸内切酶AarI位点包括所述限制性核酸内切酶AarI的识别位点和切割位点，如所示：5'...CACCTGCN4↓...3'；3'...GTGGACGN8↑...5'。实施例2利用毕赤酵母CRISPRCas9基因编辑载体对毕赤酵母mcherry基因进行基因敲除实验本发明实施例的毕赤酵母CRISPRCas9基因编辑载体的获得方法包括以下步骤：1利用sgRNA设计网站如http:crispr.dbcls.jp辅助设计需要编辑基因的sgRNA包括PAM，根据sgRNA序列设计引物，针对一条sgRNA，分正向引物和反向引物，具体为：正向引物：Cas9-mcherry-FATCAGGATAACATGGCCATCATCA；反向引物：Cas9-mcherry-RAAACTGATGATGGCCATGTTATCC。2引物退火：将合成的引物序列配制体系，退火之后生成含有粘性末端的DNA双链；反应体系为：ddH2O14μl，10×T4pNKBuffer2μl，100μM正向引物2μl，100μM反向引物2μl。反应程序为：95℃3min，95℃到25℃缓慢冷却，例如-1℃30s。3退火产物磷酸化反应体系：ddH2O14μl，T4pNK酶1μl，0×T4pNKBuffer2μl，ATP10mM1μl，退火产物2μl。反应程序：37℃，30min，T4PNK酶公司：NEB，货号：M0201。4酶切骨架载体：用AarI酶进行酶切公司：thermo，货号：ER1581进行酶切，单一条带，切胶回收。5连接程序为：16℃30min～1h，备注：T4DNA连接酶公司：NEB；货号：M0202。6转化:取5μL连接产物加入到刚解冻的50μLDH5α感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min后，42℃热激45s，立即放冰上静止2min，加950μL、37℃预热的LB液体培养基，37℃震荡培养45min，取100μL涂于博来霉素抗性的平板。7菌落PCR验证，正向引物为sgRNA正向引物，此例为Cas9-mcherry-FATCAGGATAACATGGCCATCATCA，反向引物通用为3AOX1:GCAAATGGCATTCTGACATCC，PCR产物长度：160bp，挑取阳性单克隆菌斑，LB液体培养基摇菌，博来霉素抗性100ugml。8质粒提取，送测序，结果发现mcherry基因中有三个碱基被成功敲除图2；9获得编辑成功的菌株，并在荧光显微镜激发光下进行检测，结果表明野生型的毕赤酵母mcherry基因可以表达而显示出红色荧光附图显示为灰色，而敲除后的mcherry基因无法正常表达图3。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。序列表云南师范大学一种用于毕赤酵母的基因编辑载体pHS-AVC-LW10734SIPOSequenceListing1.017321DNA人工序列ArtificialSequence1tcagaatgccatttgcctgagagatgcaggcttcatttttgatacttttttatttgtaac60ctatatagtataggattttttttgtcattttgtttcttctcgtacgagcttgctcctgat120cagcctatctcgcagctgatgaatatcttgtggtaggggtttgggaaaatcattcgagtt180tgatgtttttcttggtatttcccactcctcttcagagtacagaagattaagtgagacctt240cgtttgtgcggatcccccacacaccatagcttcaaaatgtttctactccttttttactct300tccagattttctcggactccgcgcatcgccgtaccacttcaaaacacccaagcacagcat360actaaattttccctctttcttcctctagggtgtcgttaattacccgtactaaaggtttgg420aaaagaaaaaagagaccgcctcgtttctttttcttcgtcgaaaaaggcaataaaaatttt480tatcacgtttctttttcttgaaatttttttttttagtttttttctctttcagtgacctcc540attgatatttaagttaataaacggtcttcaatttctcaagtttcagtttcatttttcttg600ttctattacaactttttttacttcttgttcattagaaagaaagcatagcaatctaatcta660agggcggtgttgacaattaatcatcggcatagtatatcggcatagtataatacgacaagg720tgaggaactaaaccatggccaagttgaccagtgccgttccggtgctcaccgcgcgcgacg780tcgccggagcggtcgagttctggaccgaccggctcgggttctcccgggacttcgtggagg840acgacttcgccggtgtggtccgggacgacgtgaccctgttcatcagcgcggtccaggacc900aggtggtgccggacaacaccctggcctgggtgtgggtgcgcggcctggacgagctgtacg960ccgagtggtcggaggtcgtgtccacgaacttccgggacgcctccgggccggccatgaccg1020agatcggcgagcagccgtgggggcgggagttcgccctgcgcgacccggccggcaactgcg1080tgcacttcgtggccgaggagcaggactgacacgtccgacggcggcccacgggtcccaggc1140ctcggagatccgtcccccttttcctttgtcgatatcatgtaattagttatgtcacgctta1200cattcacgccctccccccacatccgctctaaccgaaaaggaaggag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权利要求：1.一种用于毕赤酵母的基因编辑载体pHS-AVC-LW1073，其特征在于，所述的载体pHS-AVC-LW1073包括质粒pGAPZaA、sgRNA元件和Cas9元件，所述的sgRNA元件由sgRNA启动子、sgRNAbackbone和靶点插入酶切位点组成，所述的Cas9元件为编码基因Cas9的全长CDS序列并且N端加有核定位信号SV40NLS。2.根据权利要求1所述的一种用于毕赤酵母的基因编辑载体pHS-AVC-LW1073，其特征在于，所述的载体pHS-AVC-LW1073的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。3.根据权利要求1所述的一种用于毕赤酵母的基因编辑载体pHS-AVC-LW1073，其特征在于，所述的gRNA元件具体区域为SEQIDNO.1所示序列的第6904-7274的核苷酸序列。4.根据权利要求1所述的一种用于毕赤酵母的基因编辑载体pHS-AVC-LW1073，其特征在于，所述的sgRNA启动子为pSNR52，具体为SEQIDNO.1所示序列的第6094-7172的核苷酸序列。5.根据权利要求1所述的一种用于毕赤酵母的基因编辑载体pHS-AVC-LW1073，其特征在于，所述的sgRNA元件识别受体菌的目的DNA，所述受体菌的目的DNA具有5’-NX-NGG-3’结构，NX表示X个N，N为A、G、C或T，X可为大于5的一个自然数。6.根据权利要求1所述的一种用于毕赤酵母的基因编辑载体pHS-AVC-LW1073，其特征在于，所述的靶点插入酶切位点为AarI，酶切位点信息为：5'...CACCTGCN4↓...3'；3'...GTGGACGN8↑...5'。7.根据权利要求1所述的一种用于毕赤酵母的基因编辑载体pHS-AVC-LW1073，其特征在于，所述的Cas9元件具体区域为SEQIDNO.1的第2176-8619的核苷酸序列。8.根据权利要求1所述的一种用于毕赤酵母的基因编辑载体pHS-AVC-LW1073，其特征在于，所述的载体pHS-AVC-LW1073序列SEQIDNo.1的第735-1109位的核苷酸序列为博来霉素抗性基因。

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