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申请/专利权人：中国科学院城市环境研究所

摘要：本发明涉及分子生物学技术领域，公开了一种基于Pacbio测序的16SrDNA全长文库高通量构建的技术方法，包括以下步骤：S1、设计与合成带标签的扩增引物：引物的5’端带有标签序列，并且5’端磷酸化修饰，引物的3’端为扩增子的特异性引物，并经HPLC纯化；S2、点样仪以含有5184个微孔的芯片作为载体，根据不同通量组合，完成芯片制备，进行PCR扩增，芯片中的扩增产物混合收集至离心管；S3、扩增产物进行纯化，末端修复和加A反应等，文库上机测序。基于此方法得到测序结果显示，与常规建库方法得到的物种组成结构和丰度高度一致。本技术发明大大地简化了实验操作流程，具有基因文库构建的高通量优势，提高了建库效率，缩短了实验周期，减少了试剂耗材等成本。

主权项：1.一种基于Pacbio测序的16SrDNA全长文库高通量构建的技术方法，其特征在于：包括以下步骤：S1、设计与合成带标签的扩增引物：每个待测样本设计并合成一对扩增子的扩增引物，其中每对引物的5’端带有标签序列，并且5’端磷酸化修饰，每对引物的3’端为扩增子的特异性引物，引物采用HPLC纯化；S2、扩增子样本的扩增：S2.1、配置反应液：取一个经过灭菌并烘干的384孔板，在孔内配置芯片制备的反应液；S2.2、设置仪器：将MSDN点样仪的模式选为384×12模式，喷液体积100nl。其中384代表384个样本，12代表12次重复，即每个384孔板的孔内试剂会喷入芯片的12个孔中，每个芯片孔反应体系为100nl；S2.3、芯片制备：将配置好的384孔板放入MSND点样仪特定位置，将SmartChip芯片也放入到MSND点样仪特定位置，点击开始，MSND点样仪将自动把384孔板中的文库构建所需的PCR反应体系喷入5184孔SmartChip芯片孔内，待运行完成，将SmartChip芯片取下，盖上芯片膜，2600xg离心5分钟；S2.4、上机扩增：将SmartChip芯片放入PCR仪，盖上盖子进行PCR扩增；S3、收集扩增产物：PCR结束之后，将芯片取出，2600xg离心5分钟后小心撕掉芯片膜，避免膜的胶残留在芯片上；组装芯片配备的收集槽，将收集槽放置到附带的离心架上；将芯片倒扣在收集槽上，贴上封槽膜；2600xg离心10分钟，结束后，将离心管取下，做好标记；S4、用0.6倍的AMPurePB磁珠对扩增产物进行纯化；S5、取上述纯化产物500ng进行DNA损伤修复；S6、对步骤S5中产物进行末端修复和加A反应；S7、对步骤S6获得的产物与测序接头进行连接反应；S8、经0.6倍的AMPurePB磁珠纯化步骤S7得到的连接产物后，即可得到基于PacBio测序平台的扩增子混样测序文库。

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