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申请/专利权人：中国科学院微生物研究所

摘要：本发明涉及一种通过异源表达thaxtomin生物合成基因簇发酵生产thaxtominA、thaxtominB或thaxtominD的方法。在优选的实施方式中，进一步应用合成生物学策略，使用基因簇编辑技术对thaxtomin生物合成途径进行重新设计，将组成型强启动子元件插入到基因簇中的txtAB、txtED和或txtC操纵子转录起始位点的上游，进而提高thaxtomin的产量。

主权项：1.一种生产thaxtomin的方法，所述方法包括在异源链霉菌中表达酸性疮痂链霉菌的TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE，以及对所述异源链霉菌进行发酵；其中，所述异源链霉菌选自于如下的任一种链霉菌：天蓝色链霉菌以及白色链霉菌；所述thaxtomin选自于由如下化合物所组成的组中的一种：thaxtominA、thaxtominB以及thaxtominD。

全文数据：提高thaxtomin发酵产量的方法技术领域本发明涉及微生物工程领域。更具体而言，本发明涉及利用合成生物学方法对thaxtomin表达菌株的thaxtomin生物合成基因簇进行异源表达，提高thaxtomin的产量。背景技术thaxtomin是由植物病原体链霉菌产生的一类植物毒素，可造成植物块根或块茎发生木栓化疮痂状病变。已经发现thaxtomin抑制正在发育的植物细胞合成纤维素，因此能够将其作为天然除草剂，控制农田杂草生长而不对作物产生毒性CN104284583A。此外，还可将thaxtomin用于控制藻类污染CN101677561A。目前已知产生thaxtomin的链霉菌有4种，分别是疮痂链霉菌Streptomycesscabies、酸性疮痂链霉菌Streptomycesacidiscabies、番薯链霉菌Streptomycesipomoea以及肿痂链霉菌Streptomycesturgidiscabies。已报道制备包括thaxtominA、thaxtominB、thaxtominC和thaxtominD在内的多种thaxtomin类化合物的化学合成方法J.Gelin等，J.Org.Chem.58，1993，第3473-3475页；J.Moyroud等，Tetrahedron52，1996，第8525-8543页；US20140275541。另外，加拿大已经批准将灭活的酸性疮痂链霉菌RL-110T菌株直接用作除草剂。然而目前，发酵生产thaxtomin类化合物的工艺仍存在发酵周期长需要7-10天以及产量低天然产thaxtomin菌株的发酵产量一般为约20μgmL等缺陷。虽然本领域已预测出thaxtomin生物合成通路中的功能基因Appl.Microbio.Biotechmol.，2013，97:8439-8453；NatureChemicalBiology，8:814-816，2012；AntonievanLeeuwenhoek，2008，94:3-10；FrancisIM等，2015，doi:10.1128mBio.02018-14，然而，本领域还没有能够有效改进thaxtomin合成通路从而提高thaxtomin产量的方法。发明内容在第一方面，本发明提供了一种生产thaxtomin的方法，所述方法包括在异源链霉菌中表达酸性疮痂链霉菌Streptomycesacidiscabies的thaxtomin基因簇中的thaxtomin非核糖体肽合成酶ATxtA、thaxtomin非核糖体肽合成酶BTxtB、细胞色素P450型单加氧酶TxtC、NO合酶加氧酶TxtD以及4-硝基色氨酸合成酶TxtE，以及对所述异源链霉菌进行发酵；其中，所述异源链霉菌选自于如下的任一种链霉菌：天蓝色链霉菌Streptomycescoelicolor、白色链霉菌Streptomycesalbus以及委内瑞拉链霉菌Streptomycesvenezuelae。在第二方面，本发明提供了一种提高thaxtomin产量的方法，所述方法包括将编码酸性疮痂链霉菌的TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE的片段转化至异源链霉菌；其中，所述异源链霉菌选自于如下的任一种链霉菌：天蓝色链霉菌、白色链霉菌以及委内瑞拉链霉菌。在第三方面，本发明提供了一种细菌，所述细菌表达酸性疮痂链霉菌的TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE；其中，所述细菌选自于如下的任一种链霉菌：天蓝色链霉菌、白色链霉菌或委内瑞拉链霉菌。附图说明图1为目前预测的thaxtominA体内合成途径。图1a显示thaxtomin基因簇结构。其中，txtA-txtE和txtR的转录产物分别是TxtA-TxtE和TxtR。txtA和txtB位于同一操纵子且转录偶联合称为txtAB。txtD和txtE之间间隔很短，推测也为同一操纵子合称为txtED。未标注部分推测与转座酶相关。TxtA-TxtE和TxtR序列在疮痂链霉菌、酸性疮痂链霉菌和肿痂链霉菌中保守。图1b显示thaxtomin体内合成途径。其中，化合物1为thaxtominD。化合物2为L-4-硝基色氨酸。图2显示根据实施例1，构建pSET156-thax质粒的原理图。pSET156-thax为带有酸性疮痂链霉菌thaxtomin基因簇的重组质粒。在体外利用sgRNA介导的Cas9对酸性疮痂链霉菌基因组thaxtomin基因簇的上下游进行切割，并将其连入线性化的大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pSET156质粒，得到带有酸性疮痂链霉菌thaxtomin基因簇的重组质粒pSET156-thax。图3显示根据实施例2，对天然宿主和各异源链霉菌宿主发酵液中thaxtominA进行检测的结果。图3a为发酵液的HPLC检测结果。检测在380nm紫外光下进行。ThaxtominAstandard为thaxtominA标准样品Sigma，指示thaxtominA的出峰时间在4.6min。S.acidiscabies为野生型酸性疮痂链霉菌发酵液的HPLC结果，S.lividansThax、S.venezuelaeThax、S.coelicolorThax以及S.albusThax分别为带有pSET156-thax质粒的变铅青链霉菌、委内瑞拉链霉菌、天蓝色链霉菌以及白色链霉菌发酵液的HPLC结果。图3b为对图3a的定量分析，显示不同异源宿主的thaxtominA发酵产量。图3c为对带有pSET156-thax质粒的天蓝色链霉菌S.coelicolorThax的发酵液进行LC-MS测试的结果；“ThaxtominA”表示作为对照的thaxtominA标准品的LC-MS测试结果。图4显示根据实施例3，对thaxtomin基因簇进行优化。图4a为改造的示意图。thax为酸性疮痂链霉菌的野生型thaxtomin基因簇。thax-pAE为针对酸性疮痂链霉菌野生型thaxtomin基因簇，在txtA的上游插入启动子SPL42，在txtE的上游插入启动子SPL43，并删除SPL42与SPL43之间的片段，该片段包含txtR和与产生thaxtominA无关的基因。thax-pAEC为在进行thax-pAE改造的基础上，进一步在txtC的上游插入启动子SPL30。图4b为野生型和经改造的各天蓝色链霉菌发酵液中thaxtominA的浓度。图4c为野生型和经改造的各委内瑞拉链霉菌发酵液中thaxtominA的浓度。图5为根据实施例4，对txtAB、txtED和txtC操纵子的启动子进行组合优化。图5a为针对各操纵子的候选启动子的示意图。图5c为各菌株对应的启动子组合。图5b为各菌株的thaxtominA发酵产量。具体实施方式本发明通过异源表达thaxtomin生物合成基因簇，使得对缺少其背景研究的天然宿主进行基因通路改造成为可能。通过在背景清晰的异源宿主中对基因簇功能模块进行重构和优化，避免了天然宿主内源的复杂调控的限制。在一些实施方式中，通过在天蓝色链霉菌、白色链霉菌或委内瑞拉链霉菌中表达TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE，重构thaxtominA合成通路的功能。在一些实施方式中，通过将酸性疮痂链霉菌的thaxtomin基因簇整体转化异源链霉菌宿主，实现所述异源表达。在另一些实施方式中，可将编码TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE的各片段转化异源链霉菌宿主，实现所述异源表达。thaxtomin生物合成通路在不同种的致病链霉菌中高度保守，催化各步骤的酶均位于链霉菌染色体的致病岛pathogenicityisland。在本领域中，致病岛也被称为thaxtomin基因簇或thaxtomin生物合成基因簇。虽然致病岛在不同的链霉菌中有可能自发水平转移，但研究表明，这种自发水平转移后致病岛的基因在新宿主中几乎不表达。仅有极少数的突变株由于发生基因组水平特别是调控元件和顺式作用元件的突变而出现基因转录。有报道表明，致病岛外的其它基因也参与对thaxtomin生物合成的调控。例如，通过敲除编码纤维二糖感应蛋白的基因cebR，酸性疮痂链霉菌的thaxtominA产量能够提高约10倍TheCellobioseSensorCebRistheGatekeeperofStreptomycesscabiespathogenicity，mBio，2015。目前已知的能够由链霉菌产生的thaxtomin类化合物包括thaxtominA、thaxtominB、thaxtominC和thaxtominD。其中，thaxtominA为由疮痂链霉菌、酸性疮痂链霉菌和肿痂链霉菌天然产生。thaxtominB和thaxtominD是thaxtominA合成的中间产物。ThaxtominC由番薯链霉菌天然产生。疮痂链霉菌、酸性疮痂链霉菌和肿痂链霉菌的thaxtomin基因簇非常相似。如图1a所示出的，上述三种链霉菌的thaxtomin基因簇均包含txtA-txtE的保守的编码序列和调控基因txtR，以及位于txtA和txtE之间除了txtR外的不保守序列。该不保守序列包含例如与基因簇的定植和转移相关的转座酶等序列。一般认为酸性疮痂链霉菌的thaxtomin基因簇包含其染色体片段NZ_BCMK01000007.1的第132205bp-156019bp的序列。thaxtomin属于二酮哌嗪类化合物，它是由两个氨基酸衍生物通过肽键缩合而成的环二肽。二酮哌嗪类化合物的生物合成通常藉由非核糖体肽合成酶NRPS途径进行。NRPS多为以模块化形式存在的多功能复合酶系。基本的NRPS至少包括三个催化功能域：缩合结构域Condensationdomain，C域、腺苷化结构域Adenylationdomain，A域和肽酰载体蛋白结构域Peptidecarrierprotein，PCP域，其中A域负责底物氨基酸的识别与活化，并将活化后的氨基酸转移至PCP域上形成氨酰化硫酯，C域催化PCP域上的氨酰化硫酯的氨基与上游模块中PCP上的氨酰化硫酯的羧基缩合形成肽键。此外，经NRPS途径合成的二酮哌嗪类化合物的修饰主要包括异戊烯基化、甲基化或羟基化等。负责催化这些反应的修饰酶基因通常与非核糖体肽合成酶基因成簇存在，反应可能发生在NRPS组装之前或之后。在thaxtominA合成通路中，NRPS酶是TxtA和TxtB。TxtA和TxtB除具有NRPS酶的A-PCP-C基本结构域外，在A-PCP之间还存在一个甲基化酶结构域M域。TxtA和TxtB催化以ATP和Mg2+作为辅因子，从L-4-硝基色氨酸、L-苯丙氨酸和S-腺苷-L-甲硫氨酸SAM组装为N,N’-二甲基二酮哌嗪骨架的反应图1。其中，L-4-硝基色氨酸为以L-色氨酸作为底物并以NO和O2作为共同底物，以菠菜铁氧还蛋白spinachferredoxin和铁氧还蛋白还原酶ferredoxinreductase作为替代电子供体反应生成。催化该NRPS组装之前L-Trp中芳香环C4位硝基化反应的酶是TxtE。TxtE对底物具有很强的立体选择性。序列比对表明TxtE是一类独特的P450氧化酶，其功能域不同于其它P450的相应区域。作为上述色氨酸硝化反应底物的NO由L-精氨酸在一氧化氮合酶NOS的催化下产生。该NOS为txtD编码。本领域也将TxtD称为NO合酶加氧酶。此外，TxtC编码催化环二肽组装后对二酮哌嗪六元环进行羟基化的细胞色素P450型单加氧酶ApplMicrobiolBiotechnol2013，97：8439-8453；二酮哌嗪类化合物生物合成研究进展，微生物学通报，2014。本领域已知晓的是，TxtA、TxtB、TxtC、TxtD和TxtE催化从基本氨基酸L-色氨酸和L-苯丙氨酸合成thaxtominA的全路径。此外，研究发现，TxtC催化羟基化步骤之前的中间体thaxtominD和thaxtominB也具有除草剂活性。本领域已经知晓能够发酵生产thaxtominA、thaxtominB和thaxtominD的方法CN103339251B。如上所述，Thaxtomin合成簇还包括编码调控蛋白TxtR和一些具有转座酶功能的蛋白的序列。TxtR是AraCXylS家族转录调控因子，TxtR与纤维二糖的相互作用能够激活thaxtomin合成通路的开启。研究表明，txtR基因的敲除减少TxtA、TxtB和TxtC的积累Thaxtominbiosynthesis:thepathtoplantpathogenicityinthegenusStreptomyces，AntonievanLeeuwenhoek，2008。在本发明优选的实施方式中，通过敲除txtR并添加链霉菌组成型强启动子，能够使得TxtA-TxtE的表达不再需要纤维二糖或其它纤维素衍生物的诱导。本领域已经对酸性疮痂链霉菌的基因组NZ_BCMK01000007.1进行了注释，标注了txtA-txtE和txtR的编码序列CDS。TxtA-TxtE和TxtR及其相应的基因序列txtA-txtE和txtR在表1中列出。根据Genbank的注释以及blast能够知晓的是，酸性疮痂链霉菌TxtA-TxtE和TxtR的蛋白序列与疮痂链霉菌的上述蛋白的序列同源性非常高。表1在一些实施方式中，对txtAB、txtC、txtD以及txtE基因中一个或多个的启动子进行改造，利用链霉菌通用的强启动子控制上述基因的表达，能够进一步增强thaxtomin的产量。此外，对酸性疮痂链霉菌内源启动子的改造能够避免使用纤维二糖作为诱导剂，因此无需表达TxtR。在优选的实施方式中，所述在异源链霉菌中表达酸性疮痂链霉菌的TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE的步骤进一步包括：在txtAB和txtED操纵子的上游添加链霉菌组成型强启动子。在更优选的实施方式中，所述在异源链霉菌中表达酸性疮痂链霉菌的TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE的步骤进一步包括：在txtAB、txtED和txtC操纵子的上游添加链霉菌组成型启动子。也可在txtA-txtE中的一个或多个基因CDS的上游添加组成型启动子。优选地，通过在txtA的CDS上游第1bp-1000bp的任一位置、更优选30-100bp处的任一位置处添加链霉菌组成型强启动子，实现在txtAB操纵子上游添加链霉菌组成型启动子。优选地，通过在txtE的CDS上游第1bp-1000bp的任一位置、更优选30-100bp处的任一位置添加链霉菌组成型强启动子，实现在txtED操纵子上游添加链霉菌组成型启动子。优选地，通过在txtC的CDS上游第1bp-1000bp的任一位置、更优选30-100bp处的任一位置添加链霉菌组成型强启动子，实现在txtC操纵子上游添加链霉菌组成型启动子。本领域已知多种可用于天蓝色链霉菌、白色链霉菌或委内瑞拉链霉菌的强启动子，例如如如表2所列出的ermEp系列启动子、SF14P系列启动子、kasOP系列启动子，但并不限于此。上述启动子系列中各启动子名称及序列为本领域所知晓。表2定义本文使用的术语thaxtomin具有本领域公知的含义，其为哌嗪2,5-二酮环的天然衍生物，在3位具有4-硝基吲哚-3-基甲基取代且在2位具有苄基取代，该苄基进一步任选地被OH取代。thaxtomin均具有环-L-4-硝基色氨酰-L-苯丙氨酰基本结构，可通过如式I所示的通式表示：thaxtominA：R1是甲基，R2是羟基，R3是甲基，R4是H，R5是羟基，R6是H。thaxtominB：R1是甲基，R2是羟基，R3是甲基，R4是H，R5是H，R6是H。thaxtominD：R1是甲基，R2是氢，R3是甲基，R4是H，R5是H，R6是H。在本发明中，thaxtomin可为thaxtominA、thaxtominB或thaxtominD，其结构分别如式II-式IV所示。本发明所使用的异源链霉菌为常用的工业菌种天蓝色链霉菌、白色链霉菌以及委内瑞拉链霉菌。优选地，可使用的天蓝色链霉菌S.coelicolor包括M512、M1146和M1154菌株；可使用的白色链霉菌S.albus包括J1074菌株；可使用的委内瑞拉链霉菌S.venezuelae包括ATCC10712、ATCC15439等菌株。本领域所知晓的是，异源表达的基因可存在于质粒或被整合入异源宿主的基因组。本领域知晓在天蓝色链霉菌、白色链霉菌以及委内瑞拉链霉菌中表达异源蛋白所使用的质粒以及转化和表达方法。特别地，就转化而言，可使用大片段整体转化方法例如catch方法[6]等或对各片段进行单独转化例如使用传统的酶切连接、Gibson组装等方法。本发明中使用的术语“组成型启动子”具有本领域公知的含义，指的是无需外源诱导即可开启下游基因转录的顺式作用元件。不希望被理论所限地，也可使用链霉菌通用的诱导型启动子进行本发明的启动子改造。由实施例可以看出，根据本发明的一些实施方式，通过变更宿主，thaxtomin的发酵产量能够提高36％以上。在一些优选的实施方式中，在变更宿主的基础上进一步地对启动子进行改造，与野生型相比，改造菌株的thaxomin产量可提高3-20倍以上。本文所述各方面的实施方式可由如下编号的段落说明：1.一种生产thaxtomin的方法，所述方法包括在异源链霉菌中表达酸性疮痂链霉菌的TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE，以及对所述异源链霉菌进行发酵；其中，所述异源链霉菌选自于如下的任一种链霉菌：天蓝色链霉菌、白色链霉菌以及委内瑞拉链霉菌。2.如段落1所述的方法，其中，所述thaxtomin选自于由如下化合物所组成的组中的一种：thaxtominA、thaxtominB以及thaxtominD。3.如段落1或2所述的方法，其中，将酸性疮痂链霉菌的thaxtomin基因簇整体转化入所述异源链霉菌，实现在所述异源链霉菌中表达酸性疮痂链霉菌的TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE。4.如段落3所述的方法，其中，所述thaxtomin基因簇包含酸性疮痂链霉菌染色体的132205bp-156019bp的序列。5.如段落1或2所述的方法，其中，将编码TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE的各片段转化入所述异源链霉菌，实现在所述异源链霉菌中表达酸性疮痂链霉菌的TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE。6.如段落5所述的方法，其中，所述异源链霉菌不表达TxtR。7.如段落1-6中任一项所述的方法，其中，所述在异源链霉菌中表达酸性疮痂链霉菌的TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE的步骤进一步包括：在txtAB和txtED操纵子的上游添加链霉菌组成型启动子。8.如段落1-6中任一项所述的方法，其中，所述在异源链霉菌中表达酸性疮痂链霉菌的TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE的步骤进一步包括：在txtAB、txtED和txtC操纵子的上游添加链霉菌组成型启动子。9.如段落1-6中任一项所述的方法，其中，所述在异源链霉菌中表达酸性疮痂链霉菌的TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE的步骤进一步包括：在所述酸性疮痂链霉菌的txtA、txtB、txtC、txtD以及txtE的CDS的上游添加链霉菌组成型启动子。10.如段落7-9中任一项所述的方法，其中，在txtA的CDS上游第1bp-1000bp处的任一位置、优选30-100bp处的任一位置添加链霉菌组成型启动子。11.如段落7-10中任一项所述的方法，其中，在txtE的CDS上游第1bp-1000bp处的任一位置、优选30-100bp处的任一位置添加链霉菌组成型启动子。12.如段落8-11中任一项所述的方法，其中，在txtC的CDS上游第1bp-1000bp处的任一位置、优选30-100bp处的任一位置添加链霉菌组成型启动子。13.如段落7-12中任一项所述的方法，其中，所述链霉菌组成型启动子选自于由如下启动子所组成的组：ermEp系列启动子、SF14P系列启动子、kasOP系列启动子。14.如段落7-12中任一项所述的方法，其中，所述链霉菌组成型启动子选自于如下的启动子：ermE、21、ermE*、A9、A3、B10、57、ermEp1*、ermEp1、B4、61、81、C5、Tcp、SF14P、KasOP*、gapdhpSGa、rpsLpSGa、gapdhpKRa、gapdhpTPa、rpsLpCFa、rpsLpTPa、gapdhpELa、gapdhpREa、rpsLpREa、gapdhpSAa、rpsLpSAa、gapdhpSVa、以及SP1-SP44。15.一种提高thaxtomin产量的方法，所述方法包括将编码酸性疮痂链霉菌的TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE的片段转化至异源链霉菌；其中，所述异源链霉菌选自于如下的任一种链霉菌：天蓝色链霉菌、白色链霉菌以及委内瑞拉链霉菌。16.如段落15所述的方法，其中，所述thaxtomin选自于由如下化合物所组成的组中的一种：thaxtominA、thaxtominB以及thaxtominD。17.如段落15或16所述的方法，其中，将酸性疮痂链霉菌的thaxtomin基因簇整体转化入所述异源链霉菌。18.如段落17所述的方法，其中，所述thaxtomin基因簇包含酸性疮痂链霉菌染色体的132205bp-156019bp的序列。19.如段落15或16所述的方法，其中，将编码TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE的片段各自转化入所述异源链霉菌。20.如段落19所述的方法，其中，所述异源链霉菌不表达TxtR。21.如段落15-20中任一项所述的方法，其中，所述将编码酸性疮痂链霉菌的TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE的片段转化至异源链霉菌进一步包括：在所述转化之前，在txtAB和txtED操纵子的上游添加链霉菌组成型启动子。22.如段落15-20中任一项所述的方法，其中，所述将编码酸性疮痂链霉菌的TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE的片段转化至异源链霉菌进一步包括：在所述转化之前，在txtAB、txtED和txtC操纵子的上游添加链霉菌组成型启动子。23.如段落15-20中任一项所述的方法，其中，所述将编码酸性疮痂链霉菌的TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE的片段转化至异源链霉菌进一步包括：在所述转化之前，在所txtA、txtB、txtC、txtD以及txtE的CDS的上游添加链霉菌组成型启动子。24.如段落21-23中任一项所述的方法，其中，在txtA的CDS上游第1bp-1000bp的任一位置、优选30-100bp处的任一位置处添加链霉菌组成型启动子。25.如段落21-24中任一项所述的方法，其中，在txtE的CDS上游第1bp-1000bp的任一位置、优选30-100bp处的任一位置添加链霉菌组成型启动子。26.如段落22-25中任一项所述的方法，其中，在txtC的CDS上游第1bp-1000bp的任一位置、优选30-100bp处的任一位置添加链霉菌组成型启动子。27.如段落21-26中任一项所述的方法，其中，所述链霉菌组成型启动子选自于由如下启动子所组成的组：ermEp系列启动子、SF14P系列启动子、kasOP系列启动子。28.如段落21-26中任一项所述的方法，其中，所述链霉菌组成型启动子选自于如下的启动子：ermE、21、ermE*、A9、A3、B10、57、ermEp1*、ermEp1、B4、61、81、C5、Tcp、SF14P、KasOP*、gapdhpSGa、rpsLpSGa、gapdhpKRa、gapdhpTPa、rpsLpCFa、rpsLpTPa、gapdhpELa、gapdhpREa、rpsLpREa、gapdhpSAa、rpsLpSAa、gapdhpSVa、以及SP1-SP44。29.一种细菌，所述细菌表达酸性疮痂链霉菌的TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE；其中，所述细菌选自于如下的任一种链霉菌：天蓝色链霉菌、白色链霉菌或委内瑞拉链霉菌。30.如段落29所述的细菌，其中，所述thaxtomin选自于由如下化合物所组成的组中的一种：thaxtominA、thaxtominB以及thaxtominD。31.如段落29或30所述的细菌，其中，将酸性疮痂链霉菌的thaxtomin基因簇整体转化入所述异源链霉菌，使得所述细菌表达酸性疮痂链霉菌的TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE。32.如段落31所述的细菌，其中，所述thaxtomin基因簇包含酸性疮痂链霉菌染色体的132205bp-156019bp的序列。33.如段落29或30所述的细菌，其中，将编码TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE的各片段转化入所述异源链霉菌，使得所述细菌表达酸性疮痂链霉菌的TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE。34.如段落33所述的细菌，其中，所述细菌不表达TxtR。35.如段落29-35中任一项所述的细菌，其中，所述细菌的txtAB和txtED操纵子的上游添加有链霉菌组成型启动子。36.如段落29-35中任一项所述的细菌，其中，所述细菌的txtAB、txtED和txtC操纵子的上游添加有链霉菌组成型启动子。37.如段落29-35中任一项所述的细菌，其中，所述细菌的txtA、txtB、txtC、txtD以及txtE的CDS的上游添加有链霉菌组成型启动子。38.如段落35-37中任一项所述的细菌，其中，所述细菌的txtA的CDS上游第1bp-1000bp处的任一位置、优选30-100bp处的任一位置添加有链霉菌组成型启动子。39.如段落35-38中任一项所述的细菌，其中，所述细菌的txtE的CDS上游第1bp-1000bp处的任意任一位置、优选30-100bp处的任一位置添加有链霉菌组成型启动子。40.如段落36-39中任一项所述的细菌，其中，所述细菌的txtC的CDS上游第1bp-1000bp处的任意任一位置、优选30-100bp处的任一位置添加有链霉菌组成型启动子。41.如段落35-40中任一项所述的细菌，其中，所述链霉菌组成型启动子选自于由如下启动子所组成的组：ermEp系列启动子、SF14P系列启动子、kasOP系列启动子。42.如段落35-40中任一项所述的细菌，其中，所述链霉菌组成型启动子选自于如下的启动子：ermE、21、ermE*、A9、A3、B10、57、ermEp1*、ermEp1、B4、61、81、C5、Tcp、SF14P、KasOP*、gapdhpSGa、rpsLpSGa、gapdhpKRa、gapdhpTPa、rpsLpCFa、rpsLpTPa、gapdhpELa、gapdhpREa、rpsLpREa、gapdhpSAa、rpsLpSAa、gapdhpSVa、以及SP1-SP44。实施例试剂和培养基如无特别说明，全部试剂来自于FisherScientific。LB固体和液体培养基、2×YT培养基以及YPD液体和固体培养基、SC培养基、酵母转化用缓冲液请参见《分子克隆实验指南》下册第三版，科学出版社，2002年附录2的培养基部分。酵母选择培养基SC-Ura请参见CN105624146A。MS固体培养基：将10g豆粉、10g甘露醇、20g琼脂溶于1L纯水，121℃高压灭菌20min。TSB液体培养基：购自BD公司。燕麦培养基，将20g燕麦煮沸过滤后溶于1L纯水，调pH7.0-7.2。实施例1-4中使用的引物序列如表3所示。表3实施例中使用的出发载体为pSET156SEQ.ID.NO：33。该载体为大肠杆菌-链霉菌穿梭载体。thaxtomin基因簇克隆自酸性疮痂链霉菌CGMCC4.1789中国普通微生物菌种保藏中心。利用大肠杆菌EscherichiacoliEPI300菌株Epicentre公司作为克隆菌株。使用大肠杆菌ET12567PUZ8002菌株[7]作为大肠杆菌-链霉菌接合转移用菌株，基因簇编辑所用宿主为高转化率的酿酒酵母SaccharomycescerevisiaeVL6-48菌株购自AmericanTypeCultureCollection，ATCC编号MYA-3666。在本发明的各定量测量中，对于每个菌株的发酵实验独立进行三次，每次发酵实验对发酵液进行三次测量，将平均值作为该次实验的测量值，利用三次实验的测量值计算平均值和标准差。实施例1制备带有thaxtomin基因簇的质粒pSET156-thax如图2所示，利用Catch方法[6]克隆thaxtomin基因簇。1sgRNA的制备：设计针对thaxtomin基因簇NCBIgeneID：NZ_BCMK01000007.1的132205bp-156019bp上游和下游约1kb的sgRNA-thaxF和sgRNA-thaxR。sgRNA-thaxF和sgRNA-thaxR的体外转录模板为利用重叠PCR的方法制备。以表3中的引物guideRNA-F、guideRNA-R和thax-gF-P进行重叠PCR，获得sgRNA-thaxF体外转录模板；以表3中的引物guideRNA-F、guideRNA-R和thax-gR-P进行重叠PCR，获得sgRNA-thaxR体外转录模板。利用PCR纯化试剂盒Omega-D6492纯化回收sgDNA体外转录模板。利用NEB商用试剂盒实施利用T7RNA聚合酶的体外转录，获得针对所述thaxtomin基因簇的上下游位点的sgRNAsgRNA-thaxF、sgRNA-thaxR，将获得的全部sgRNA在-20℃保存。2酸性疮痂链霉菌基因组的提取及酶切：在28℃、MS固体培养基上活化酸性疮痂链霉菌。7天后刮取孢子，将孢子接入50mlTSB液体培养基，28℃培养48h。离心收集菌丝，按照链霉菌提取手册[11]提取基因组。在体外利用Cas9核酸酶和步骤1得到的sgRNA-thaxF和sgRNA-thaxR对酸性疮痂链霉菌基因组进行酶切，所述酶切体系为：其中所述5×缓冲液成分为100mMHEPESpH7.5；750mMKCl；0.5mMEDTA；50mMMgCl2。该反应在37℃进行2h。通过琼脂糖凝胶电泳进行产物检测，利用乙醇沉淀法回收thaxtomin基因簇片段，该thaxtomin基因簇片段为NCBIgeneID：NZ_BCMK01000007.1的第132205bp-第156019bp。3制备带有thaxtomin基因簇两端同源臂的载体片段：分别以引物thax-156-F和thax-156-R为上下游引物，以原始载体pSET156为模板通过PCR扩增获得带有同源臂序列的载体片段。利用PCR纯化试剂盒Omega-D6492纯化回收上述带有同源臂的载体片段。4连接和转化：取50ng带有同源臂的载体片段和1μg基因组酶切片段进行Gibson组装，50℃反应1h。取2μl反应产物电转化至大肠杆菌EPI300菌株，37℃摇床复苏1h。将菌液涂布在含有安普霉素抗生素50μgmL的LB平板上，培养过夜。5转化子的鉴定及重组克隆的提取：通过菌落PCR反应鉴定阳性克隆。对阳性菌落进行培养，提取质粒，将该质粒命名为pSET156-thax，其带有thaxtomin基因簇NCBIgeneID：NZ_BCMK01000007.1的第132205bp-第156019bp。实施例2thaxtomin基因簇在多种异源链霉菌宿主中的表达分别将pSET156-thax质粒转入如下的链霉菌：白色链霉菌StreptomycesalbusJ1074[8]；变铅青链霉菌StreptomyceslividansTK24[9]；委内瑞拉链霉菌StreptomycesvenezuelaeISP5230ATCC10712；天蓝色链霉菌StreptomycescoelicolorM1154[10]。1pSET156-thax质粒的接合转移[11]：首先利用CaCl2法将pSET156-thax质粒转化至大肠杆菌ET12567PUZ8002菌株，在含有安普霉素50μgmL、氯霉素15μgmL以及卡那霉素50μgmL的LB平板上培养。长出转化子后，挑取转化子单菌落接种于含有上述三种抗生素的2mLLB液体培养基中，37℃培养过夜；将过夜培养物以10％的比例接种到4mL相同抗性的新鲜的LB液体培养基中，37℃摇床培养4～5h后OD值为0.4～0.66000rpm离心2min，收集菌体；用新鲜的LB培养基洗涤菌体两次。分别将白色链霉菌、变铅青链霉菌、委内瑞拉链霉菌和天蓝色链霉菌接种于MS平板，28℃培养6～7天后刮取孢子，用2×YT培养基悬浮。每个接合转移样品使用约108个孢子500μL。将孢子悬浮液50℃热激10分钟，室温冷却；将等体积的大肠杆菌菌体含pSET156-thax质粒及链霉菌孢子在1.5mL离心管中轻弹混匀，均匀涂布于含有10mMMgCl2的MS平板上。28℃孵育6h委内瑞拉链霉菌或16～20h白色链霉菌、变铅青链霉菌或天蓝色链霉菌后，用溶有1mg萘啶酮酸和1.5mg安普霉素的1mL无菌水均匀覆盖。28℃培养5-7天长出单菌落后，在含有安普霉素50μgmL和萘啶酮酸25μgmL的MS平板上划线进行培养。通过菌落PCR反应验证阳性克隆。通过这样的方式获得带有pSET156-thax质粒的白色链霉菌、变铅青链霉菌、委内瑞拉链霉菌和天蓝色链霉。2各异源宿主的thaxtominA表达量检测。对步骤1获得的含有pSET156-thax质粒的各异源宿主以及野生型酸性疮痂链霉菌进行发酵培养，首先将各链霉菌接种到TSB培养基，28℃、200rpm培养2d装量为50mL250mL后，将1mL培养物转接到燕麦培养基中，28℃、200rpm培养8d装量为50mL250mL后，吸取1mL发酵液加入1mL甲醇中，振荡6小时后静置30分钟。取1mL发酵液的甲醇提取液，12000rpm离心10min。取上清液，经0.2μm滤膜过滤后进行HPLC分析和LC-MS分析图3。HPLC分析使用SHIMADZU超高压液相色谱LC-30A，波长为380nm；条件为：C18反相柱，柱长250mm，柱内径4.6mm；流动相为乙腈:水＝40:60；流速为1.0mLmin；进样体积为2μL。thaxtominA标准品Sigma，产品编号SML1456浓度为100μgmL。LC-MS分析仪器为Agilent1260ABQtrap4500MS，采用正负离子模式全扫描方式检测，质荷比mz范围设定为100～1000。如图3a所示。在HPLC色谱图中，测试样品中可能含有的thaxtominA应在与标准品对应的保留时间出峰，峰的面积表明thaxtominA的表达量。可以看出，在所检测的各宿主中，酸性疮痂链霉菌内源表达thaxtominA。带有pSET156-thax质粒的白色链霉菌和天蓝色链霉菌表达thaxtominA，其表达量高于天然宿主酸性疮痂链霉菌作为对照，含有空载体pSET156质粒的异源宿主均无thaxtominA对应峰，数据未示出。如图3b所示，针对HPLC图谱的定量分析表明，白色链霉菌和天蓝色链霉菌中thaxtominA的产量分别为33.75μgmL和54.55μgmL。与酸性疮痂链霉菌中thaxtominA的内源表达量相比，thaxtomin基因簇在白色链霉菌和天蓝色链霉菌中的异源表达分别将产量提高了36％和120％。进一步地，对天蓝色链霉菌的异源表达产物进行LC-MS分析，结果如图3c所示，通过分析与标准品对应峰的质谱结果，可以看到明显的正离子峰mz439[M+H]+以及明显的负离子峰436.5[M-H]-，推测化合物分子量为438，这个结果与标准品的质谱结果基本吻合。实施例3对thaxtomin基因簇中的txtED、txtAB和txtC基因进行启动子优化利用CN105624146A的方法，将thaxtomin基因簇中的txtED、txtAB和txtC操纵子的启动子改造为链霉菌的组成型强启动子，进一步提高thaxtominA的异源表达产量。如图4a所示，将酸性疮痂链霉菌的野生型基因簇片段Thax改造为Thax-pAE以及Thax-pAEC。其中，片段Thax-pAE为将强启动子SPL42和SPL43分别插入至酸性疮痂链霉菌的thaxtomin基因簇Thax基因txtA和txtE上游；片段Thax-pAEC为将强启动子SPL42、SPL43和SPL30分别插入至酸性疮痂链霉菌的thaxtomin基因簇基因txtA、txtC和txtE的上游。上述启动子为工业链霉菌菌株通用的启动子，序列请参见表2或文献[5]。此外，对于txtA和txtE之间包含的txtR以及在对于各thaxtomin基因簇而言不保守的序列，txtR编码纤维二糖应答性激活蛋白，而不保守序列据推测与基因簇的转移和维持相关，在改造时去除txtA和taxE基因中间的片段。改造后的片段Thax-pAE和Thax-pAEC仅包含txtA、txtB、txtC、txtD和txtE。另外，为便于连接操作，在pSET156-thax质粒基因簇的上游插入酵母复制子和筛选标记。需要说明的是，在实施例3和实施例4中，以“SPL”命名的各启动子对应于参考文献[5]中以“SP”命名的各启动子。例如，本发明实施例中使用的启动子“SPL42”即为参考文献[5]中的启动子“SP42”。1thaxtomin基因簇编辑位点的选取在thaxtomin基因簇的txtE基因CDS上游36bp处、txtA基因CDS上游43bp处、txtC基因CDS的上游40bp处以及thaxtomin基因簇上游p1位置SEQ.ID.NO：33序列6003bp处设计sgRNA，该p1位置用于酵母元件的插入。2sgRNA的制备：利用重叠PCR的方法制备各sgRNAsgRNA-thaxE、sgRNA-thaxA、sgRNA-thaxC和sgRNA-p1体外转录模板。重叠PCR所使用的引物参见表3。sgRNA-thaxE体外转录模板制备所用引物为guideRNA-F、guideRNA-R和thax-txtE-P；sgRNA-thaxA体外转录模板制备所用引物为guideRNA-F、guideRNA-R和thax-txtA-P；sgRNA-thaxC体外转录模板制备所用引物为guideRNA-F、guideRNA-R和thax-txtC-P；sgRNA-p1体外转录模板制备所用引物为guideRNA-F、guideRNA-R和thax-P1。方法如实施例1，将获得的全部sgRNA在-20℃保存。3pSET156-thax质粒的cas9酶切：在体外利用Cas9核酸酶和获得的sgRNA对pSET156-thax质粒进行两组酶切。第一组：利用sgRNA-thaxE、sgRNA-thaxA和sgRNA-p1切割pSET156-thax质粒针对图4a的Thax-pAE；第二组：利用sgRNA-thaxE、sgRNA-thaxA、sgRNA-thaxC和sgRNA-p1切割pSET156-thax质粒针对图4a的Thax-pAEC；所述酶切体系为：该反应在37℃进行2h。通过琼脂糖凝胶电泳进行产物检测，利用乙醇沉淀法回收酶切后的所有片段。4组成型启动子片段制备制备如下带有启动子和侧翼的片段：txtE-spl43：以表3中的引物spl43F和spl43R进行overlapPCR。txtA-spl42：以表3中的引物spl42F和spl42R进行overlapPCR。txtC-spl30：以表3中的引物spl30F和spl30R进行overlapPCR。其中，各片段的启动子两端分别带有40bp与Thax上相应的cas9酶切位点上下游序列一致的同源臂。分别以引物URA-F和URA-R，以及引物CENARSF和CENARSR制备供重组质粒在酵母菌进行筛选标记和复制子片段URASEQ.ID.NO：34和CENARSSEQ.ID.NO：35。利用PCR纯化试剂盒Omega-D6492纯化回收上述带有同源臂的各片段。5连接和转化：利用醋酸锂转化的方法分别将如下的两组片段转化入酵母细胞：itxtE-spl43即，带有txtE处同源臂的SPL43、txtA-spl42即，带有txtA处同源臂的SPL42、酵母筛选标记URA片段及复制子CENARS片段以及步骤3的第一组酶切产物；iitxtE-spl43、txtA-spl42、txtC-spl30即，带有txtC处同源臂的spl30、酵母筛选标记URA片段及复制子CENARS片段以及步骤3的第二组酶切产物；步骤如下：a：将酵母宿主VL6-48从甘油管活化至YPD固体平板上，30℃培养48h。挑取单菌落到1～2mLYPD培养基中，过夜培养测OD600，根据OD值按比例用YPD稀释至OD600＝0.1。继续培养2.5h，此时OD达到0.4。每份转化需OD值0.4的菌液5mL。若OD值大于0.4，需用YPD稀释至0.4。b：2500rcf室温离心菌液5min，用醋酸锂溶液1体积10×TE，pH7.5、1体积10×醋酸锂、8体积无菌超纯水，终浓度100mM洗涤两次，轻柔吹打。每5mL收集的菌体用30μL醋酸锂100mM进行悬浮，在离心菌体的同时处理鲑鱼精DNAssDNA，煮沸5min后迅速放在冰上，避免双链DNA退火。c：准备如下的转化缓冲体系。将该体系于30℃孵育30min，随后42℃热休克15min。d：2500rcf室温离心1min，弃去上清。用150μLYPD液体培养基温柔重悬细胞，在30℃摇床上复苏2～3h。最后将菌液涂布在SC-Ura营养缺陷固体培养基上，培养48h。转化缓冲体系为6筛选和获得重组载体：对在选择性培养基上生长的菌落进行菌落PCR，挑选Thax-pAE质粒第i组片段的连接产物或Thax-pAEC质粒第ii组片段的连接产物的阳性克隆，提取质粒进行保存。Thax-pAE质粒和Thax-pAEC质粒的基因簇基因型如图4a。利用与实施例2相同的方法，将Thax-pAE或Thax-pAEC质粒转化入异源宿主天蓝色链霉菌或委内瑞拉链霉菌，并进行发酵培养。如图4b所示，引入强启动子后，天蓝色链霉菌的thaxtominA的产量大幅度提高。带有Thax-pAE质粒txtED和txtAB操纵子前分别插入SPL43和SPL42的天蓝色链霉菌S.coelicolorThax-pAE产thaxtominA的产量达到281.25μgmL。带有Thax-pAEC质粒txtED、txtAB和txtC操纵子前分别插入SPL43、SPL42和SPL30的天蓝色链霉菌S.coelicolorThax-pAEC产thaxtominA的产量达到298μgmL。可见，能够通过引入链霉菌的组成型强启动子进一步增加thaxtominA的产量。此外，如图4c所示，引入强启动子后，原本在委内瑞拉链霉菌中沉默的thaxtomin基因簇被激活，带有Thax-pAE质粒的委内瑞拉链霉菌S.venezuelaeThax-pAE产thaxtominA的产量达到73μgmL。带有Thax-pAEC质粒的委内瑞拉链霉菌S.venezuelaeThax-pAEC产thaxtominA的产量达到60μgmL。可见，能够通过引入链霉菌组成型强启动子激活thaxtomin基因簇。实施例4应用不同强度的启动子库优化thaxtominA生物合成在发明人之前筛选的链霉菌启动子库[5]中挑选了多组不同强度的启动子对txtED、txtAB和txtC的转录进行组合优化。如图5a所示，针对txtED挑选了SPL11、SPL24和SPL43；针对txtAB挑选了SPL12、SPL23和SPL42；针对txtC挑选了SPL10、SPL22和SPL30。对这些启动子进行如图5c的组合，将上述启动子组合分别插入txtED、txtAB和txtC上游各位点，并将改造的质粒转化至天蓝色链球菌，构建菌株M1-M27。启动子优化的方法同实施例3，所用的引物请参见表3例如，带有侧翼的SPL10为以表3中的引物spl10F和spl10R进行overlapPCR获得。在图5c中，例如，菌株M1具有的启动子组合为E11A12C10，表示在txtED前插入启动子SPL11，在txtAB前插入启动子SPL12，在txtC前插入启动子SPL10；菌株M27具有的启动子组合为E43A42C30，表示在txtED前插入启动子SPL43，在txtAB前插入启动子SPL42，在txtC前插入启动子SPL30。其它菌株的启动子以相同的方式给出。启动子插入位点、质粒和方法均与实施例3相同。菌株M1-M27发酵生产thaxtominA的产量如图5b所示。经改造的菌株产thaxtominA的产量在254μgmL-505μgmL。可见，与在天然宿主中的产量相比，本实施例的方法能够将thaxtominA的含量提高20倍以上。参考文献1.T.Siegl,B.Tokovenko,M.MyronovskyiandA.Luzhetskyy,Metab.Eng.,2013,19,98–106.2.G.Labes,M.BibbandW.Wohlleben,Microbiology,1997,1435,1503–1512.3.W.Wang,X.Li,J.Wang,S.Xiang,X.FengandK.Yang,Appl.Environ.Microbiol.,2013,79,4484–4492.4.ShaoZ,RaoG,LiC,AbilZ,LuoY,ZhaoH..ACSSynthBiol.2013,211,662-6695.C.Bai,Y.Zhang,X.Zhao,Y.Hu,S.Xiang,J.Miao,C.LouandL.Zhang,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2015,112,12181–12186.6.JiangW,ZhaoX,GabrieliT,LouC,EbensteinY,ZhuTF.NatureCommunications.2015.7.MacNeil,D.J.etal.Gene1992,111,61–68.8.ChaterKF,WildeLC.JBacteriol1976,128:644–650.9.P.Cruz-Morales,E.Vijgenboom,F.Iruegas-Bocardo,G.Girard,L.A.-Guerra,H.E.GenomeBiolEvol.2013,5,1165-1175.10.Gomez-EscribanoJP,BibbMJ.MethodsEnzymol.2012；517:279-300.11.T.Kieser,M.J.Bibb,M.J.Buttner,K.F.Chater&D.A.Hopwood.PracticalStreptomycesGenetics.TheJohnInnesFoundation.2000.序列表中国科学院微生物研究所提高thaxtomin发酵产量的方法35SIPOSequenceListing1.0140DNAArtificialSequence人工序列1gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtc40259DNAArtificialSequence人工序列2aaaagcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagccttattttaact59361DNAArtificialSequence人工序列3taatacgactcactataggtccgcgtccgtcatgtccgagttttagagctagaaatagca60a61461DNAArtificialSequence人工序列4taatacgactcactataggcgatcgagagcgtgaacgcagttttagagctagaaatagca60a61561DNAArtificialSequence人工序列5taatacgactcactataggggaattcctgccgcgatcccgttttagagctagaaatagca60a61661DNAArtificialSequence人工序列6taatacgactcactataggatcggcttga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权利要求：1.一种生产thaxtomin的方法，所述方法包括在异源链霉菌中表达酸性疮痂链霉菌的TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE，以及对所述异源链霉菌进行发酵；其中，所述异源链霉菌选自于如下的任一种链霉菌：天蓝色链霉菌、白色链霉菌以及委内瑞拉链霉菌。2.一种提高thaxtomin产量的方法，所述方法包括将编码酸性疮痂链霉菌的TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE的片段转化至异源链霉菌；其中，所述异源链霉菌选自于如下的任一种链霉菌：天蓝色链霉菌、白色链霉菌以及委内瑞拉链霉菌。3.一种细菌，所述细菌表达酸性疮痂链霉菌的TxtA、TxtB、TxtC、TxtD以及TxtE；其中，所述细菌选自于如下的任一种链霉菌：天蓝色链霉菌、白色链霉菌或委内瑞拉链霉菌。

百度查询： 中国科学院微生物研究所 提高thaxtomin发酵产量的方法