申请/专利权人：广州准优生物科技有限公司;广东横琴联合生命科学有限责任公司

申请日：2024-04-12

公开（公告）日：2024-06-07

公开（公告）号：CN118147046A

主分类号：C12N5/071

分类号：C12N5/071;A61K35/36;A61P17/14

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2024.06.25#实质审查的生效;2024.06.07#公开

摘要：本发明提供了一种从头皮组织分离培养毛囊干细胞的方法及应用。本发明是利用干细胞增殖肽构建了毛囊干细胞促增殖完全培养基，并以此完成了毛囊干细胞的分离、培养和传代。经验证得出，本发明的方法得到的毛囊干细胞具备优越的增殖特性，且存活率较高，有利于后续制备高纯度、高存活率的毛囊干细胞悬液制剂。同时，本发明的毛囊干细胞悬液制剂原材料采集于制剂使用者本身，故不诱导免疫排斥反应；且能在体外大规模扩增，来源充足；且分离方法简单、且成本低廉。

主权项：1.一种毛囊干细胞的提取及扩增培养方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：1在无菌环境下，从脱发患者的脑后枕部采集10～15个完整单位毛囊，采集后的毛囊，放入预冷至4℃的含80-100UmL硫酸庆大霉素的DMEM基础培养基中，4℃条件下进行保存运输，运送至实验室中；2在超净台中用无菌镊取出毛囊，转移至100mm细胞培养皿中，并用含80-100UmL硫酸庆大霉素的无钙镁离子磷酸盐缓冲液重复清洗；并用无菌平板镊刮去毛囊表面杂质、血渍及去除毛发；3无菌平板镊夹取毛囊，转移至15mL离心管中，加入10mL的含0.0125-0.05％胰酶和1-3mgmLⅠ型胶原酶混合液中，重复浸泡毛囊，并置于37℃水浴震荡消化1-2小时；消化结束后加入5mL胎牛血清进行终止消化，并用200目筛网进行过滤，收集至50mL离心管中；4向步骤3的15mL离心管再次加入15mL生理盐水，收集残余细胞，并用200目筛网进行过滤，收集至所述50mL离心管中，并用生理盐水定容至50mL；5将步骤4定容后50mL离心管进行1500-1800rpmmin，离心10-20min；离心结束后，用10mL移液管弃去上清液，注意不要触碰到底层沉淀；并用10mL完全培养基重悬底部沉淀，接种至25cm2培养瓶中，置于37℃，CO2培养箱中进行培养，并于每四天进行半量换液，即为原代毛囊干细胞；其中，所述完全培养基为含有5-10ngmL干细胞增殖肽、10-20ngmLEGF、1.5-5mmolmLL-谷氨酰胺、10-25％vv胎牛血清、2-15μM青链霉素双抗溶液的DMEM基础培养基；其中，所述干细胞增殖肽的序列如SEQIDNO.1-3所示；6待到原代毛囊干细胞融合度至80-95％以上时，取出培养瓶置于超净台中；向培养瓶中加入10mL生理盐水摇晃，使瓶底细胞被浸润，清洗细胞表面残余培养液，清洗结束后用移液器弃去生理盐水；7向培养瓶中加入3mL0.025-0.05％胰酶，使瓶底细胞被胰酶浸润，在显微镜下观察细胞形态；至大部分细胞脱落悬浮，显微镜观察成透亮球状时，加入10mL完全培养基终止消化，用10mL移液管吹打瓶底，使细胞脱离瓶底混入液体中，并将液体转移至50mL离心管中；8向步骤7的培养瓶中再次加入10mL氯化钠注射液至培养瓶中，用10mL移液管吹打瓶底，收集残余细胞悬液，并将液体转移至所述50mL离心管中，并用生理盐水定容至50mL；9将步骤8定容后50mL离心管进行1500-1800rpmmin，离心10-20min；离心结束后，将离心管中的上清液吸出，加入10mL新鲜完全培养基，吹打混匀，接种至75cm2培养瓶中，置于37℃，CO2培养箱中进行培养，并于每四天进行半量换液，即为传代毛囊干细胞。

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