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申请/专利权人：中国人民解放军空军军医大学

摘要：本发明公开了一种具有牙周炎抗氧化应激效应的功能性纳米酶的制备方法及应用，涉及生物医药技术领域，具体包含以下步骤：S1：人牙周膜干细胞分离提取和培养；S2：人牙周膜干细胞膜囊泡的制备；S3：功能性纳米酶的制备。本发明的功能性纳米酶针对牙周炎症微环境中细胞超氧化物阴离子（O2·‑）和过氧化氢（H2O2）代谢失调问题，具有改善细胞过度氧化应激状态的能力，同时兼具良好的体外生物安全性。

主权项：1.一种具有牙周炎抗氧化应激效应的功能性纳米酶的制备方法，其特征在于：具体包含以下步骤：S1：人牙周膜干细胞分离提取和培养：S11：收集因正畸或阻生需拔除的第三磨牙，用添加了100UmL青霉素和100μgmL链霉素的PBS溶液充分冲洗干净收集的牙齿，并剪除牙齿上附着的牙龈组织；用镊子夹持牙冠部位，再用刀片小心刮取牙根中13表面的牙周膜组织，将得到的组织剪成组织块，于I型胶原酶溶液中消化，离心弃上清，得到消化后的牙周膜组织；S12：将消化后的牙周膜组织重悬于完全培养基，置于37℃、5%CO2细胞孵箱中培养，每3天更换1次完全培养基，至细胞融合度达90%时传代，得到P1代人牙周膜干细胞，传至P3-P5代细胞用于后续实验；S2：人牙周膜干细胞膜囊泡的制备：S21：将生长状态良好的牙周膜干细胞使用预冷的PBS缓冲液洗涤2遍，每2000万个细胞重悬于盛有1mL膜蛋白抽提试剂A的EP管中，将该EP管放于液氮中进行速冻后再放于37℃水浴锅解冻，重复3次冻融循环后，于4℃，700g下离心10min收集上清，再将上清于4℃，16000g下离心30min收集沉淀，得到干细胞膜，-80℃短期保存；S22：使用脂质体挤出器挤压步骤S21得到的干细胞膜，依次通过400nm、200nm孔径的聚碳酸酯膜，制备得到人牙周膜干细胞膜囊泡，备用；S3：功能性纳米酶的制备：将步骤S22得到的人牙周膜干细胞膜囊泡与中空介孔二氧化锰纳米颗粒水溶液置于脂质体挤出器，先后分别通过孔径为1000nm、400nm和200nm的多孔聚碳酸酯膜，反复挤压20~25个循环，使纳米颗粒被干细胞膜囊泡充分包被，得到的混合物在超声波浴下超声，随后将混合物在4℃离心以去除未结合的膜囊泡，获得功能性纳米酶，于EDTA水溶液保存。

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