申请/专利权人：南方医科大学

申请日：2017-11-28

公开（公告）日：2018-05-29

公开（公告）号：CN108078971A

主分类号：A61K31/185(2006.01)I

分类号：A61K31/185(2006.01)I;A61K31/439(2006.01)I;A61K31/7072(2006.01)I;A61K31/551(2006.01)I;A61K31/513(2006.01)I;A61K31/505(2006.01)I;A61P31/18(2006.01)I

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的驳回

法律状态：2021.04.23#发明专利申请公布后的驳回;2018.06.22#实质审查的生效;2018.05.29#公开

摘要：本发明公开了Suramin在制备SEVI形成抑制剂中的应用。本发明经过一系列研究发现，Suramin具有显著的抑制精液淀粉样纤维SEVI形成的活性，其也能抑制SEVI结合HIV，从而抑制HIV的感染。Suramin本身具有抗病毒活性，并且在精液中与其它抗病毒药物联合应用具有协同抗病毒作用。家兔安全性评价实验体系证明，Suramin对阴道上皮细胞基本无毒。鉴于精液淀粉样纤维SEVI能显著促进HIV性传播，本发明所述的Suramin能通过抑制精液淀粉样纤维SEVI的形成和功能，可作为HIV性传播阻断剂。

主权项：Suramin在制备SEVI形成抑制剂中的应用。

全文数据：Suramiη在制备SEVI形成抑制剂中的应用技术领域[0001]本发明涉及一种药物化合物的新用途，特别涉及Suramiη在制备SEVI形成抑制剂中的应用。背景技术[0002]艾滋病（Acquiredimmunodeficiencysyndrome，AIDS由人类免疫缺陷病毒Humanimmunodeficiencyvirus，HIV引起的人类最严重的单一病因疾病之一，严重威胁着世界的安全和人类生存。根据2013年联合国艾滋病规划署报告，全球范围内，2012年仍有约250万人新感染HIV，170万艾滋病的死亡，新感染病例中，80%是通过性传播感染的，在非洲一些国家更高达90%，性传播已成为HIV最主要的传播途径。由于现在尚无可预防艾滋病的疫苗，因此急需研发可用于预防HIV性传播的杀微生物剂。[0003]杀微生物剂是一类含有抗HIV成分的凝胶、乳脂、栓剂、药膜或海绵，在性交前置入阴道或肛门内，通过直接灭活HIV、阻止HIV粘附或侵入阴道或直肠粘膜内的靶细胞、抑制HIV在靶细胞的复制等作用机理，预防HIV和其它性传播病原体的传播。因此，杀微生物剂能使性伙伴即使在不使用安全套的情况下避免感染HIV。更重要的是，杀微生物剂的使用可被女性所控制，从而为女性自主预防HIV性传播提供了有效措施。这在女性地位比较低的发展国家如非洲和性工作者中预防艾滋病非常关键。最近研究表明，在性传播中，男男同性恋传播HIV的比例在近几年逐年上升，因此开发能预防男男同性恋传播的直肠杀微生物剂也非常迫切。虽然最近美国食品药品监督管理局已经通过一种口服复方抗病毒药物（TDFFTC，Truvada4:?，.GileadScience用于预防高危人群的HIV性传播，但口服抗病毒药物用于预防HIV性传播带来的影响不可忽略，例如:增加耐药病毒株的产生、药物的全身毒副作用、阴道粘膜直肠粘膜有效药物浓度低等。。而局部使用的杀微生物剂，由于具有阴道粘膜直肠粘膜局部药物浓度高、不需要全身给药等特点，在预防HIV性传播方面具有良好的前景。[0004]迄今为止超过二十个杀微生物剂产品已进入临床试验的各个阶段，但其中7个已结束IlbIII期大规模临床试验N_9,Savvy，UshercelI，Carraguard，BufferGel，PR0_2000和Carbopol974P，均先后宣布失败或被中止。含l%Tenofovir的阴道凝胶制剂作为候选的杀生物剂在南非完成了IIb期临床试验CAPRISA004试验），结果显示其能有效降低39%人群感染HIV，尤其对于用药高依附性人群，降低感染率高达54%。但Tenofovir的另一个大规模的临床试验却证明无效VOICE试验）。杀微生物剂尚无有效的产品面世。综合其中的原因有：（1受试药物抗病毒活性不够，比如对性传播主要的CCR5辅助受体依赖的病毒株抑制效果差;应选择抗病毒效果更好的单方或复方联用药物用于试验；（2受试药物诱导的宿主机体炎症反应限制其临床应用，应选择安全性更佳的药物用于试验；（3受试药物的使用依从性差。[0005]德国Ulmx大学的munch等发现精液中存在一些降解的多肽片段，这些水解的多肽片段能形成淀粉样沉淀，从而促进HIV感染靶细胞。他们把这种增强病毒感染的淀粉样纤维命名为精液来源的病毒感染增强因子Semen-derivedEnhancerofVirusInfection，SEVI。SEVI促进HIV病毒感染的作用机理主要与其极强的阳离子特性有关，SEVI能通过捕获HIV，协助病毒与宿主细胞相互作用，从而增强HIV感染。SEVI能促进病毒感染同时会降低抗病毒药物的药效，因此，SEVI近年来成为杀微生物剂的靶点之一！[0006]精液来源的淀粉样纤维能大大促进病毒感染，从而导致HIV性传播的几率大大提高，另一方面，精液来源的淀粉样纤维的存在，能使现有绝大部分的抗病毒药效下降，包括聚阴离子化合物、中和抗体、逆转录酶抑制剂等。因此，精液来源的淀粉样纤维是杀微生物剂开发的一个新的，重要的靶点。[0007]由于在精液中分别发现天然存在的淀粉样纤维原性多肽和淀粉样纤维，淀粉样纤维是由淀粉样原性多肽聚合而成的，淀粉样纤维才具有增强病毒感染的能力。因此，活性化合物分别抑制原性多肽，使其不能聚集形成淀粉样纤维，或靶向淀粉样纤维、解散淀粉样纤维，使其不能增强病毒感染，均可开发为潜在的多效杀微生物剂。[0008]目前为止，不同的研究小组已开发拮抗精液淀粉样纤维的活性小分子，这些活性化合物主要包括：IEGCG表没食子儿茶素没食子酸酯能使SEVI纤维分解从而拮抗其增强HIV感染的过程;2RoanNR等人发现，氨基喹啉类小分子化合物Surfen能干扰SEVI与HIV病毒颗粒及靶细胞结合，拮抗其促进病毒感染的能力；3金属离子和非天然的氨基酸抑制剂能抑制SEVI的形成;4OlsenJS等人研究发现，结构和硫磺素T类似化合物BTA-EG6能特异性和淀粉样纤维结合，从而抑制HIV病毒颗粒和祀细胞的结合;5Garlicacid能特异性与淀粉样纤维结合，从而抑制HIV病毒颗粒与靶细胞的结合。尽管这些化合物能拮抗SEVI增强病毒感染的活性，但它们的作用机制比较单一，只是作用在SEVI三方面的其中之一，有一定的局限性。[0009]—药多靶点现在逐渐成为新药开发的新思路之一，此方法不仅能带来更好的治疗效果，而且能降低多药联用带来的毒副作用。[00Ί0]Suramin是一种多磺酸萘醌盐类，其临床应用历史悠久。最早由Bayer公司在1940年开发，用于治疗抗蠕虫感染和抗非洲锥虫病。现已发现Suramin有强大的药理作用，阻断生长因子和相应受体结合，并对蛋白酶类有一定的抑制作用，现阶段正处于一项临床前研究阶段用于治疗IIIBIV的非小细胞肺癌和处于II期临床阶段的用于多形性胶质母细胞和肾上腺皮质癌的治疗。未有报导显示Suramin可以抑制SEVI产生。发明内容[0011]本发明的目的在于提供Suramin在制备SEVI形成抑制剂中的应用。[0012]发明人通过实验发现，Suramin可以有效抑制SEVI的形成，同时能有效阻断SEVI结合HIV-I病毒，可以有效阻断HIV经性传播。同时Suramin还有较好的抗病毒活性，对多种微生物具有杀伤作用，作为SEVI形成抑制剂或HIV性传播阻断剂使用时，具有独特的优势。[0013]—种外用HIV性传播阻断剂，由辅料和活性成分Suramin组成。[0014]作为上述外用HIV性传播阻断剂的进一步改进，其剂型选自灌肠剂、栓剂、凝胶剂或乳脂。[0015]作为上述外用HIV性传播阻断剂的进一步改进，还添加有可接受的抗病毒化合物。[0016]作为上述外用HIV性传播阻断剂的进一步改进，抗病毒化合物为抗HIV病毒化合物。[0017]作为上述外用HIV性传播阻断剂的进一步改进，抗HIV病毒化合物选自maraviroc、AZT、Nevirapine、Raltegravir、TMCl20中的至少一种。[0018]作为上述外用HIV性传播阻断剂的进一步改进，Suramin与HIV病毒化合物的摩尔混合比为：[0019]Suraminimaraviroc=580：1；[0020]Suramin:AZT=2900:1；[0021]Suramin:Nevirapine=232:1；[0022]Suramin:Raltegravir=1812.5：I[0023]Suramn:TMC120=5370.4:l。[0024]特别的，在精液中，Suramin与抗病毒药物联用，可以进一步提升其抗病毒活性，进一步提高其对HIV经性传播的阻断效果。附图说明[0025]图1是Suramin抑制PAP248-286纤维化的量效关系曲线（刚果红染色法）；[0026]图2是Suramin抑制多肽PAP248-286形成淀粉样纤维透射电镜图（标尺:200nm，放大倍数20,000X;[0027]图3是不同浓度Suramin存在下SEVI促进病毒感染的作用A:R5嗜性的HIV-1sfi62，B:X4嗜性的HIV-1NL4-3，C:双嗜性的HIV-I81AandNL4-3;[0028]图4是Suramin阻断淀粉样纤维SEVI捕获HIV-I病毒（病毒结合实验），***p〈0.001vsSEVI组；[0029]图5是Suramin对阻断不同纤维捕获HIV-I病毒的共聚焦显微观察结果A:淀粉样纤维;B:精液内源性纤维;标尺=1Ομπι;[0030]图6是Suramin拮抗SEVI介导的增强HIV-I感染的能力的实验结果A:R5受体嗜性的HIV-1sfi62;B:X4受体嗜性的HIV-1Nl4-3;C:双嗜性的HIV-I81AandNL4-3;n=3，mean土SEM〇ns表示与SEVI组相比不具有统计学差异（p0.05，*p〈0.05vsSEVI组，林p〈0.01vsSEVI组，***p〈0.001vsSEVI组）；[0031]图7是Suramin抑制HIV-I感染能力的实验结果A:R5受体嗜性的HIV-1sfi62;B:X4受体嗜性的HIV-1NL4-3;C:双嗜性的HIV-I81AandNL4-3。具体实施方式[0032]下面结合实验，进一步说明本发明的技术方案。[0033]Suramin对SEVI形成的影响[0034]刚果红染色法：多肽PAP248-286439μΜ与各浓度Suramin220μΜ、880μΜ、3520μΜ或PBS混匀，置于37°C振荡器中在HOOrpm转速下反应，不同时间点（2h，4h，8h，12h，24h，48h取出10μ1样品与90μ1刚果红溶液Sigma混合，暗处反应15min，12000rpm离心，去掉上清，沉淀用50ylDMS0溶解，测定490nm的吸光度值，参照波长为650nm〇[0035]透射电子显微镜观察淀粉样的形态：多肽与Suramin或PBS混勾反应如上所述），不同时间点（4h，24h，取出5μ1样品溶液滴加到铜网上，滤纸吸干溶液，滴加醋酸铀染色60秒，滤纸吸干溶液，铜网自然干燥，用电镜观察淀粉样纤维形成的情况。[0036]圆二色谱分析纤维二级结构:439μΜ多肽PAP248-286与880yMSuramin或I3BS混匀，置于37°C振荡器中在HOOrpm转速下反应，不同时间点（4h、24h取样，样品用I3BS稀释成200μgml，在圆二色谱仪上扫描200〜260nm波段光谱。[0037]病毒感染增强实验：多肽与Suramin或PBS混匀反应（如上所述），不同时间点（2h，4h，8h，12h，24h，48h取样，5000rpm室温下离心IOmin，沉淀重悬在培养基中与病毒共孵加到TZM-bl细胞中，3h后换新鲜培养基，48h后，用荧光素酶检测试剂盒检测化学发光值，判断样品对病毒感染的促进作用。[0038]试验结果如图1〜3所示。图1是Suramin抑制PAP248-286纤维化的量效关系曲线（刚果红染色法）；图2是Suramin抑制多肽PAP248-286形成淀粉样纤维透射电镜图（标尺:200nm，放大倍数20,000X;图3是不同浓度Suramin存在下SEVI促进病毒感染的作用A:R5嗜性的HIV-1sfi62，B:X4嗜性的HIV-1Nl4-3，C:双嗜性的HIV-I81AandNL4-3;由图1〜3可见，Suramin能抑制PAP248-286形成SEVI纤维，同时拮抗SEVI介导的增强病毒感染的效果。[0039]Suramin对SEVI结合病毒的影响[0040]Viruspulldown实验：把已震摇成纤维的SEVI22μΜ与各浓度Suramin4·4μΜ，0·44μΜ，0·044μΜ，0·004μΜ或PBS混匀，37°C反应15min，样品5000rpm室温离心IOmin，PBS重悬沉淀，加入适量HIV-1SF162100ngmlP24，37°C孵育15min，样品5000rpm室温离心lOmin，上清和沉淀分别测定P24的含量。[0041]激光共聚焦实验：SEVI与Suramin或PBS混合，37°C共孵15min，5000rpm室温离心IOmin;ProteostatamyloidPlaque检测试剂盒进行染色，室温共孵30min，5000rpm室温离心5min;eGFP标记HIV-IR5嗜性重悬沉淀，室温共孵15min，用激光共聚焦显微镜观察。[0042]免疫荧光观察SEVI促进病毒感染CEMxl745.25M7细胞：SEVI与Suramin或PBS混合，37°C共孵15min，5000rpm室温离心IOmin;沉淀用培养基重悬，加入HIV-1SF162混匀，室温孵育5min加入细胞中，3h后换新鲜培养基，培养48h后，在荧光显微镜下观察病毒感染细胞的情况。[0043]病毒感染增强实验:SEVI与Suramin或PBS混合，37°C共孵15min，5000rpm室温下离心IOmin，沉淀重悬在培养基中与病毒共孵加到TZM-bl细胞中，3h后换新鲜培养基，48h后，用荧光素酶检测试剂盒检测化学发光值，判断样品对病毒感染的促进作用。[0044]试验结果如图4〜6所示。图4是Suramin阻断淀粉样纤维SEVI捕获HIV-I病毒病毒结合实验），*#P〈〇.001vsSEVI组；图5是Suramin对阻断不同纤维捕获HIV-I病毒的共聚焦显微观察结果A:淀粉样纤维;B:精液内源性纤维;标尺=IOym;图6是Suramin诘抗SEVI介导的增强HIV-I感染的能力的实验结果A:R5受体嗜性的HIV-1SF162;B:X4受体嗜性的HIV-1nl4-3;C:双嗜性的HIV-I81AandNL4-3;n=3，mean土SEMt3Iis表示与SEVI组相比不具有统计学差异（p0·05，*p〈0·05vsSEVI组，**p〈0·01vsSEVI组，***p〈0·001vsSEVI组）。由图4〜6可知，Suramin能有效阻断SEVI结合HIV-I病毒，阻断其增加病毒感染的能力。[0045]Suramin的安全性评价[0046]选用生长状态良好的生殖道细胞Vk2E6E7、EctE6E7、Hela、Siha等）、淋巴细胞CEMxl745.25M7、Jurkat按31051111密度接种于96孔板，10^0接种于〖4。将不同浓度的SuraminΙΟΟΟμΜ、250μΜ、62·5μΜ、15·63μΜ、3·91μΜ、0·98μΜ分别加到细胞培养板中，每组3个复孔，37°C，5%CO2培养箱孵育48h，XTT法检测Suramin对细胞的活力影响，计算CC5q。试验结果如表1所示。[0047]表I.Suramin对生殖道、淋巴细胞活力的影响[0049]试验结果表明，Suramin对两类细胞基本没有毒性，CC5q均大于ΙΟΟΟμΜ。[0050]Suramin的抗HIV-1效果[0051]选取生长状态良好的TZM-bl按11051111密度接种于96孔板，10^1^11，37°：，5%⑶2培养箱孵育过夜。Suramin倍比稀释，与100倍TCID5q不同嗜性病毒HIV-1sfi62、HIV-1NL4-3或HIV-I81AandNL4-337°C共孵30min，每孔ΙΟΟμΙ加入细胞中，48h后，用荧光素酶检测试剂盒检测化学发光值，计算IC50。[0052]图7是Suramin抑制HIV-I感染能力的实验结果A:R5受体嗜性的HIV-1sfi62;B:X4受体嗜性的HIV-1NL4-3;C:双嗜性的HIV-I81AandNL4-3。[0053]由图7可知，Suramin对HIV-I三种嗜性的病毒均有抑制作用，其IC5q分别为5.63μΜ、0·053μΜ、0·309μΜ〇[0054]Suramin和ARVs联用抑制HIV-I的效果[0055]按照以上方法Suramin和ARVs单独对HIV-I的半数抑制率值（IC5q:参考药物说明书，设置6个浓度梯度，2倍倍比稀释药物;计算各药物在不同嗜性的HIV-I病毒的IC5q。选取生长状态良好的TZM-bl按IZM-Vml密度接种于96孔板，ΙΟΟμΙwell，37°C，5%C02培养箱孵育过夜。根据各药IC5q设置药物浓度，6个浓度梯度，2倍倍比稀释药物，各浓度药物与等体积的病毒（200ng，以P24计算）混勾，在37°C共孵30min;混合液加到已铺好的细胞中，ΙΟΟμΙ孔;培养48h后，弃去培养基，PBS洗涤1次，利用荧光素酶检测试剂盒检测化学发光值RU，计算病毒抑制率。病毒抑制率％=RUpgifflrRtJffigiiRUp0®L_RUsg?i*100%阳性孔:病毒+细胞;样品孔:化合物+病毒+细胞;空白孔:细胞。两药联用效果评价:利用Compusyn软件计算药物联用指数CI值，评价其联用效果。实验结果如表2所示。[0056]表2、在精液中Suramin体外与抗病毒药物合用的协同抗病毒活性指数[0057][0058]实验结果表明，在精液中，Suramin与抗病毒药物联用，可以进一步提升其抗病毒活性，进一步提高其对HIV经性传播的阻断效果。

权利要求：1.Suramin在制备SEVI形成抑制剂中的应用。2.Suramin在制备HIV性传播阻断剂中的应用。3.—种外用HIV性传播阻断剂，由辅料和活性成分Suramin组成。4.根据权利要求3所述的一种外用HIV性传播阻断剂，其特征在于:其剂型选自灌肠剂、栓剂、凝胶剂或乳脂。5.根据权利要求3或4所述的一种外用HIV性传播阻断剂，其特征在于:还添加有可接受的抗病毒化合物。6.根据权利要求5所述的一种外用HIV性传播阻断剂，其特征在于:抗病毒化合物为抗HIV病毒化合物。7.根据权利要求6所述的一种外用HIV性传播阻断剂，其特征在于:抗HIV病毒化合物选自maraviroc、AZT、Nevirapine、Raltegravir、TMCl20中的至少一种。8.根据权利要求7所述的一种外用HIV性传播阻断剂，其特征在于=Suramin与HIV病毒化合物的摩尔混合比为：Suraminimaraviroc=580：1；Suramin:AZT=2900:1；Suramin:Nevirapine=232:1；Suramin:Raltegravir=1812.5：1Suramn:TMC120=5370.4:1。

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