申请/专利权人：君乐宝乳业集团有限公司

申请日：2018-12-06

公开（公告）日：2022-05-13

公开（公告）号：CN109536406B

主分类号：C12N1/20

分类号：C12N1/20;C12N1/02;A23C9/123;C12R1/46

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2022.05.13#授权;2019.04.23#实质审查的生效;2019.03.29#公开

摘要：本发明公开了一种弱后酸化的嗜热链球菌JMCC16，它是从内蒙古传统发酵乳中分离筛选出来的，具有很好的后酸抑制作用的菌株；该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO.11672。本发明还提供了上述弱后酸化的嗜热链球菌JMCC16的分离纯化方法和应用。本发明筛选出的嗜热链球菌JMCC16与已有嗜热链球菌相比，具有良好的抑制后酸特性，可用于功能性乳制品的开发。

主权项：1.一种弱后酸化的嗜热链球菌StreptococcusthermophilusJMCC16，其特征在于：所述弱后酸化的嗜热链球菌JMCC16的菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO.11672。

全文数据：弱后酸化的嗜热链球菌JMCC16、分离纯化方法及应用技术领域本发明属于生物工程领域，涉及一种菌株、筛选方法及应用，具体地说，是一种弱后酸化嗜热链球菌JMCC16、分离纯化方法及应用。背景技术早些年，俄罗斯生物学家及诺贝尔奖获得者梅契尼可夫就在其著作中阐述了关于长寿的研究，由此，能促进胃肠道健康的嗜热链球菌被人们所知。不久后，人们利用嗜热链球菌与德氏乳杆菌保加利亚亚种作为发酵剂菌株来生产酸奶。到目前为止，这两种菌仍是制作酸奶的主要工业菌种。嗜热链球菌属于链球菌属，是一种重要的工业乳酸菌，是可以利用乳糖同型发酵生成乳酸的兼性厌氧的革兰氏阳性菌。嗜热链球菌经常以单菌的形式，或与其他嗜热链球菌其他微生物混合的形式，被广泛应用于发酵乳制品的生产中，是主要的风味物质产生菌，对酸奶的风味影响较大。作为发酵剂的嗜热链球菌发酵乳制品时有两个重要的作用：一是快速酸化凝乳；二是改善产品的质构特征。后酸化是指酸奶产品罐装后在运输和销售过程中乳酸菌继续发酵导致酸奶进一步变酸从而影响产品品质和口感的现象。我国幅员辽阔，酸奶运输线冷链不完善，后酸问题制约着我国酸奶产业的发展，因而寻找和开发一株弱后酸菌株，特别是主要影响酸奶风味的嗜热链球菌，成为解决后酸化问题的重要手段。发明内容本发明的目的，是提供一种弱后酸化的嗜热链球菌JMCC16，能够减弱酸奶后酸化，改善酸奶的口感。本发明为实现上述目的，所采用的技术方案如下：一种弱后酸化的嗜热链球菌JMCC16，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO.11672。作为限定，它是从内蒙古传统发酵乳中分离筛选出来的。作为进一步限定，其16SrRNA序列如下：。还有一种限定，其Phes基因序列如下：。本发明还提供了一种上述弱后酸化的嗜热链球菌JMCC16的分离纯化方法，它按照以下步骤顺序进行：①采集样品取内蒙古传统发酵乳，加入生理盐水中，充分混匀，得到样品A；其中，所述发酵乳与所述生理盐水的体积比为1:9；②样品富集取样品A，加入MRS液体培养基中，35~40℃培养62~82h，得到培养液B；其中，所述样品A与MRS液体培养基的体积比为1:10~100；③菌株分离筛选取培养液B，用浓度为0.9%的无菌生理盐水10倍梯度稀释，分别为梯度稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍，得到菌悬液C1~C5；取MRS固体培养基，融化后，分别倒入培养皿，待其冷却、完全凝固后，得培养基D1~D5，分别吸取各浓度梯度的菌悬液C1~C5各0.1mL涂布到相应的培养基D1~D5上，倒置平板，置35~40℃环境下厌氧培养62~82h，观察菌落生长情况；待平板出现典型菌落后，根据标准嗜热链球菌的菌落特征以及参考相关文献图片，挑选出相应的单菌落E；④菌株纯化挑取选中的单菌落E，将菌落培养物划线接种到MRS固体培养基上，35~40℃有氧环境培养62~82h，得单菌落F；然后，再将单菌落F继续划线接种到MRS固体培养基上，35~40℃有氧环境培养62~82h，得单菌落G；再将单菌落G继续划线接种到MRS固体培养基上，35~40℃有氧环境培养62~82h，得纯培养物H；⑤菌株保存将纯培养物H与无菌的质量分数为50%甘油各取800μL，置于菌种保存管内，混匀后在-70℃保存，同时接种MRS固体培养基试管斜面用于临时保存。作为上述分离纯化方法的限定，所述MRS液体培养基原料包括：酪蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、乙酸钠、柠檬酸二胺、吐温-80、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·7H2O、蒸馏水；其中酪蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、乙酸钠、柠檬酸二胺、吐温-80、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·7H2O、蒸馏水的用量比例关系为10g：10g：5g：20g：5g：2g：1g：2g：0.2g：0.05g：1000mL；所述MRS固体培养基为每1000mLMRS液体培养基中添加15g琼脂。本发明还提供了一种上述弱后酸化的嗜热链球菌JMCC16的应用：所述该菌用于制备发酵乳制品。由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比所取得的技术进步在于：本发明的弱后酸化的嗜热链球菌JMCC16具有很好的后酸抑制作用，能够减弱酸奶后酸化，因此可以改善酸奶的风味，可应用于发酵乳制品的开发。附图说明图1为本发明实施例12中4℃实验组和对照组的酸度和pH对比；图2为本发明实施例12中15℃实验组和对照组的酸度和pH对比；图3为本发明实施例12中室温实验组和对照组的酸度和pH对比；图4为本发明实施例12中30℃实验组和对照组的酸度和pH对比。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本领域的技术人员应当理解，本发明并不限于以下实施例，任何在本发明具体实施例基础上做出的改进和变化都在本发明权利要求保护的范围之内。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1一种弱后酸化的嗜热链球菌JMCC16本实施例为一种弱后酸化的嗜热链球菌StreptococcusthermophilusJMCC16，该菌是从内蒙古传统发酵乳中分离筛选出来的，并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCCNO.11672。其16SrRNA序列如下：。其Phes基因序列如下：。实施例2一种弱后酸化的嗜热链球菌JMCC16的分离纯化方法本实施例为一种弱后酸化的嗜热链球菌JMCC16的分离纯化方法，该分离纯化方法按照以下步骤顺序进行：①样品采集取25mL内蒙古传统发酵乳，加至225mL生理盐水中，充分混匀，得到样品A1；②样品富集取2mL样品A1，加入100mLMRS液体培养基中，37℃培养72h，得到培养液B1；其中，MRS液体培养基由10g酪蛋白胨、10g牛肉膏、5g酵母膏、20g葡萄糖、5g乙酸钠、2g柠檬酸二胺、1g吐温-80、2gK2HPO4、0.2gMgSO4·7H2O、0.05gMnSO4·7H2O及1000mL蒸馏水构成；③菌株分离筛选取1mL培养液B1，用浓度为0.9%的无菌生理盐水10倍梯度稀释，分别为梯度稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍，得到菌悬液C11-C15；取MRS固体培养基，融化后，倒入培养皿，待其冷却、完全凝固后，得培养基D1，分别吸取各浓度梯度的菌悬液C11-C15各0.1mL涂布到不同培养基D1上，倒置平板，置37℃环境下厌氧培养72h，观察菌落生长情况；待平板出现典型菌落后，根据标准嗜热链球菌的菌落特征以及参考相关文献图片，挑选出相应的单菌落E1；其中，MRS固体培养基为每1000mLMRS液体培养基中添加15g琼脂；④菌株纯化挑取选中的单菌落E1，将菌落培养物划线接种到MRS固体培养基上，37℃有氧环境培养72h，得单菌落F1；然后，再将单菌落F1继续划线接种到MRS固体培养基上，37℃有氧环境培养72h，得单菌落G1；再将单菌落G1继续划线接种到MRS固体培养基上，37℃有氧环境培养72h，得纯培养物H1；⑤保存将纯培养物H1与无菌的质量分数为50%甘油各取800μL，置于菌种保存管内，混匀后在-70℃保存，同时接种MRS固体培养基试管斜面用于临时保存。实施例3-6弱后酸化的嗜热链球菌JMCC16的分离纯化方法实施例3-6分别为一种弱后酸化的嗜热链球菌JMCC16的分离纯化方法，与实施例2的方法基本相同，不同之处在于分离纯化过程的技术参数不同，具体参数如表1所示：表1实施例3-6分离纯化过程及参数。实施例7弱后酸化的嗜热链球菌JMCC16菌种的细菌学基本特征本实施例为实施例1中弱后酸化的嗜热链球菌JMCC16的细菌学基本特征，其基本特征如表2所示：表2嗜热链球菌JMCC16的基本特征。实施例8弱后酸化的嗜热链球菌JMCC16菌种的糖发酵特性本实施例为弱后酸化的嗜热链球菌JMCC16菌种的糖发酵特性。其糖发酵特性的实验方法为：将实施例3的分离纯化方法得到的弱后酸化的嗜热链球菌JMCC16菌株挑取单菌落接种至灭菌的液体MRS培养基内，37℃培养24h，取菌悬液接种至糖发酵管中，37℃培养48h，观察颜色变化。其糖发酵特性的鉴定结果如表3所示：表3嗜热链球菌JMCC16糖发酵特性的鉴定结果。注：“+”表示发酵利用；“-”表示不发酵利用。实施例9弱后酸化的嗜热链球菌JMCC16的菌种的分子生物学鉴定将采用实施例5的分离纯化方法得到的弱后酸化的嗜热链球菌JMCC16菌株进行分子生物学鉴定，通过DNA提取、PCR扩增、16SrRNA测序，NCBI网站blast最终确定为嗜热链球菌。其16SrRNA测序结果如下：。其Phes基因测序结果如下：。实施例10弱后酸化的嗜热链球菌JMCC16的菌种的菌株发酵特性取鲜牛奶80份、白砂糖10份、低聚果糖10份，调配均匀后，于60℃、15MPa下均质，95℃杀菌300s后，降温至37℃，接种106CFUmL的实施例2的分离纯化方法得到的弱后酸化的嗜热链球菌JMCC16，于37℃发酵24h，pH为4.2时停止发酵，摇匀后对实验组发酵样品进行感官品评。嗜热链球菌JMCC16的发酵样品的品评结果为顺滑，粘度、酸度适中，香气充裕。说明嗜热链球菌JMCC16发酵特性优良，可应用于制备发酵乳制品。实施例11弱后酸化的嗜热链球菌JMCC16的菌种的后酸情况分析取鲜牛奶80份、白砂糖10份、低聚果糖10份，调配均匀后，于65℃、15MPa下均质，95℃杀菌300s后，降温至37℃，得灭菌牛乳，接种嗜热链球菌JMCC16至灭菌牛乳中，接种量为灭菌牛乳质量的3%，于42℃进行发酵，检测其pH为4.5时停止发酵，得发酵产物。将发酵产物置于37℃，每两天检测其酸度，观察菌株后酸情况。后酸情况分析结果如表4所示，JMCC16在37℃适于乳酸菌生长的较高保存条件下能够良好的控制后酸。表4JMCC16发酵酸度情况。实施例12对比实施例对照组：取生牛乳90份、白砂糖10份，调配均匀后，于63℃、15MPa下均质，得发酵底物，95℃杀菌300s后，降温至38℃，于42℃接种发酵剂JLB1510（河北一然生物科技有限公司生产，批次：20180925）发酵，接种量为每kg发酵底物接种0.1g发酵剂。pH为4.0时停止发酵，记录发酵时间，摇匀后得发酵乳。将发酵乳分别放置于4℃、15℃、室温、30℃的培养箱中观察其后酸变化情况。实验组：取与对照组同一批次的相同质量份数的生牛乳、白砂糖，调配均匀后，于63℃、15MPa下均质，得发酵底物，95℃杀菌300s后，降温至38℃，于42℃接种与对照组相同质量份数发酵剂GLJLB1510（河北一然生物科技有限公司代加工的将嗜热链球菌JMCC16替换JLB1510中嗜热链球菌的改良酸奶发酵剂）发酵。pH为4.0时停止发酵，记录发酵时间，摇匀后得发酵乳。将发酵乳分别放置于4℃、15℃、室温、30℃的培养箱中观察其后酸变化情况。经过21天（酸奶保质期内）的跟踪结果如图1-4所示，通过对比可知，实验组酸度明显低于对照组，pH高于对照组，采用嗜热链球菌JMCC16的GLJLB1510发酵剂具有更好的后酸抑制效果。最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表石家庄君乐宝乳业有限公司弱后酸化的嗜热链球菌JMCC16、分离纯化方法及应用2018-12-062SIPOSequenceListing1.011407DNA嗜热链球菌Streptococcusthermophilus1ggctccaaaggttacctcaccgacttcgggtgttacaaactctcgtggtgtgacgggcgg60tgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcgtgctgatccgcgattactagcgatt120ccgacttcatgtaggcgagttgcagcctacaatccgaactgagattggctttaagagatt180agctcgccgtcaccgactcgcaactcgttgtaccaaccattgtagcacgtgtgtagccca240ggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttattaccggca300gtctcgctagagtgcccaactgaatgatggcaactaacaataggggttgcgctcgttgcg360ggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcaccga420tgtaccgaagtaactttctatctctagaaatagcatcgggatgtcaagacctggtaaggt480tcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggccccccgtcaat540tcctttgagtttcaaccttgcggtcgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctg600cggcactgaatcccggaaaggatccaacacctagcactcatcgtttacggcgtggactac660cagggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgagcctcagcgtcagttacagacca720gagagccgctttcgccaccggtgttcctccatatatctacgcatttcaccgctacacatg780gaattccactctccccttctgcactcaagtttgacagtttccaaagcgaactatggttga840gccacagcctttaacttcagacttatcaaaccgcctgcgctcgctttacgcccaataaat900ccggacaacgctcgggacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtccct960ttctggtaagctaccgtcacagtgtgaactttccactctcacacccgttcttgacttaca1020acagagctttacgatccgaaaaccttcttcactcacgcggcgttgctcggtcagggttgc1080ccccattgccgaagattccctactgctgccctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagt1140cccagtgtggccgatcaccctctcaggtcggctatgtatcgtcgcctaggtgagccatta1200cctcacctactagctaatacaacgcaggtccatcttgtagtggagcaattgcccctttca1260aataaatgacatgtgtcatccattgttatgcggtattagctatcgtttccaatagttgtc1320ccccgctacaaggcaggttacctacgcgttactcacccgttcgcaactcatccaagaaga1380gcaagctcctctcttcagcgttctact14072427DNA嗜热链球菌Streptococcusthermophilus2gcttcgcactcatacaagtcctgtccaagctcgtacacttgataaacatgatttttctaa60aggtcctcttaagatgatctcaccaggacgtgttttccgtcgtgataccgatgatgcgac120tcacagccaccagtttcaccaaatcgaaggtttggtcgttggtaaaaacatctcaatggg180tgatctgaagggaacgcttgagatgattattcaaaaaatgtttggtgcagaacgtcgaat240ccgtttgcgtccttcttacttcccattcactgaaccttccgttgaggttgacgtgtcatg300cttcaagtgtggtggtaaaggatgtaacgtatgcaagaatacaggttggattgagatcct360tggtgctggtatggttcacccacaagtgcttgagatgtcaggtgttgattctgaagaata420ttcaggt427

权利要求：1.一种弱后酸化的嗜热链球菌JMCC16，其特征在于：所述弱后酸化的嗜热链球菌JMCC16的菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO.11672。2.根据权利要求1所述的弱后酸化的嗜热链球菌JMCC16，其特征在于：它是从内蒙古传统发酵乳中分离筛选出来的。3.根据权利要求1或2所述的弱后酸化的嗜热链球菌JMCC16，其特征在于，其16SrRNA序列如下：。4.根据权利要求1或2所述的弱后酸化的嗜热链球菌JMCC16，其特征在于，其Phes基因序列如下：。5.一种如权利要求1-4中任一项所述的弱后酸化的嗜热链球菌JMCC16的分离纯化方法，其特征在于，它按照以下步骤顺序进行：①采集样品取内蒙古传统发酵乳，加入生理盐水中，充分混匀，得到样品A；其中，所述发酵乳与所述生理盐水的体积比为1:9；②样品富集取样品A，加入MRS液体培养基中，35~40℃培养62~82h，得到培养液B；其中，所述样品A与MRS液体培养基的体积比为1:10~100；③菌株分离筛选取培养液B，用浓度为0.9%的无菌生理盐水10倍梯度稀释，分别为梯度稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍，得到菌悬液C1~C5；取MRS固体培养基，融化后，分别倒入培养皿，待其冷却、完全凝固后，得培养基D1~D5，分别吸取各浓度梯度的菌悬液C1~C5各0.1mL涂布到相应的培养基D1~D5上，倒置平板，置35~40℃环境下厌氧培养62~82h，观察菌落生长情况；待平板出现典型菌落后，根据标准嗜热链球菌的菌落特征以及参考相关文献图片，挑选出相应的单菌落E；④菌株纯化挑取选中的单菌落E，将菌落培养物划线接种到MRS固体培养基上，35~40℃有氧环境培养62~82h，得单菌落F；然后，再将单菌落F继续划线接种到MRS固体培养基上，35~40℃有氧环境培养62~82h，得单菌落G；再将单菌落G继续划线接种到MRS固体培养基上，35~40℃有氧环境培养62~82h，得纯培养物H；⑤菌株保存将纯培养物H与无菌的质量分数为50%甘油各取800μL，置于菌种保存管内，混匀后在-70℃保存，同时接种MRS固体培养基试管斜面用于临时保存。6.根据权利要求5所述的弱后酸化的嗜热链球菌JMCC16的分离纯化方法，其特征在于，所述MRS液体培养基原料包括：酪蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、乙酸钠、柠檬酸二胺、吐温-80、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·7H2O、蒸馏水；其中酪蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、乙酸钠、柠檬酸二胺、吐温-80、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·7H2O、蒸馏水的用量比例关系为10g：10g：5g：20g：5g：2g：1g：2g：0.2g：0.05g：1000mL；所述MRS固体培养基为每1000mLMRS液体培养基中添加15g琼脂。7.一种如权利要求1-4中任一项所述的弱后酸化的嗜热链球菌JMCC16的应用，其特征在于：所述该菌用于制备发酵乳制品。

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