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申请/专利权人：河北农业大学
申请日：2020-06-01
公开（公告）日：2023-04-25
公开（公告）号：CN111849977B
主分类号：C12N15/113
分类号：C12N15/113;C12N15/85;C12N15/90;C12N15/66;A61D19/02;A01K67/027
优先权：
专利状态码：有效-授权
法律状态：2023.04.25#授权;2020.11.17#实质审查的生效;2020.10.30#公开
摘要：本发明涉及转基因动物技术领域，具体涉及一种精子载体制备转基因动物的方法以及一种制备转基因鸡的sgRNA和制备方法。该方法根据用于制备sgRNA的crRNA编码序列构建sgRNA与Cas9蛋白构建出共表达质粒，以精子为载体制备转基因动物。该方法通过精子载体与第三代基因编辑技术CRISPRCas9的结合，使转基因动物的制备过程操作简单，成本低，效率高，既能够用于转基因禽类动物的制备，也可以用于其他有性繁殖的转基因动物的制备。
主权项：1.一种精子载体技术在制备转基因鸡受精蛋中的应用，其特征在于，具体包括：根据靶基因设计sgRNA中的crRNA序列，根据所述crRNA序列构建sgRNA与Cas9蛋白的共表达质粒；所述sgRNA中的crRNA部分的编码链和互补链序列如SEQIDNO:1与SEQIDNO:2、SEQIDNO:3与SEQIDNO:4，或SEQIDNO:5与SEQIDNO:6中任一对人工序列所示；采集鸡的精子，将所述共表达质粒与所述精子共同孵育，获得携带共表达质粒的精子，然后人工授精，获得受精蛋；所述共表达质粒的制备方法为：将所述crRNA的编码链和互补链在合成相应的DNA单链时5´端添加与BbsI限制性内切酶线性化后的pX330质粒的粘性末端相匹配的粘性末端序列，然后两条互补单链经退火形成双链DNA；用BbsI限制性内切酶线性化pX330质粒，形成5´突出的粘性末端；将退火形成的所述双链DNA与线性化后的pX330质粒用T4DNA连接酶连接，得到所述共表达质粒；所述共同孵育的方法为：采集新鲜公鸡精液，悬浮于M199培养基混匀洗涤精浆，加入M199培养基作为孵育液，并加入所述共表达质粒和脂质体，混匀，共同孵育，获得携带共表达质粒的精子；所述脂质体相对于精液的浓度为5~7.5μlml；共同孵育的时间为10~60min，温度为37℃。
全文数据：
权利要求：
百度查询： 河北农业大学 一种精子载体制备转基因动物的方法以及一种制备矮小型转基因鸡的sgRNA和制备方法
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