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申请/专利权人：北京医院

摘要：本发明涉及DNA序列检测领域，公开了基于双扩增放大和双LNA探针特异识别DNA突变的高灵敏检测方法，步骤如下：步骤一：确定新建方法的核心反应原理，明确需评估的方法性能指标；步骤二：制备新建方法建立及验证的生物材料，包括引物、LNA探针、待测样本等；步骤三：建立新建方法的检测流程，优化新建方法的关键参数；步骤四：确定新建方法的检测阈值，评估新建方法的分析性能：包括分析敏感性、分析特异性、重复性等；步骤五：评估新建方法的临床应用价值，实现了基于双扩增放大和双LNA探针识别DNA突变的高灵敏检测新方法的建立，为DNA的灵敏、快速地检出提供技术基础，具有单核苷酸的分辨率，也可以提供技术思路，为DNA检测新技术的研发提供经验方法。

主权项：1.基于双扩增放大和双LNA探针特异识别的检测EGFRT790MDNA突变的方法，其特征在于，所述方法用于非诊断目的，包括下述步骤：步骤一：设计跨越突变位点的引物，根据DNA序列信息，设计一对跨越突变位点的引物，突变序列及相应的野生序列在该引物的作用下进行RPA反应以实现无差别的预富集，所述引物对序列如下：F3:TGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCAC和R2:CCAATATTGTCTTTGTGTTCCCGGAC；步骤二：建立碱基序列验证模板，根据突变位点的碱基序列信息，分别以pUC57-EGFRT790Mmutant质粒和A549细胞基因组DNA为模板，通过PCR技术制备100%EGFRT790M突变序列和100%EGFR野生型序列，并通过琼脂糖电泳凝胶及测序确定所制备序列长度符合预期，碱基序列准确；步骤三：建立方法的检测流程，在冰上按试剂说明书对反应组分进行预组装，其中组分A为RPA反应组分，反应体积为5ul，组分B为LNAClampPCR反应组分，反应体积为15ul，具体如下： ；其中引物FR,为F3和R2的混合物；所述抑制性LNA探针的序列为：GCAGCTCATCACGCAGCTCA;所述TaqManLNA探针的序列为：FAM-CTCATCATGCAGCTCATGCCCTTCGGC-BHQ1;下划线表示LNA修饰位点，加粗表示突变位点；分别完成组分A和B的预组装后，向组分A中加入待测样品，混匀后依次将组分B、组分A分别添加至八连管的管盖和管底，在39℃下进行30min的RPA反应,随后离心使B组分进入反应体系，反应条件为95℃反应1min，以及20个循环的95℃10sec和60℃31sec，通过ABI7500仪器实时监测荧光变化；步骤四：分析待测样本的实时荧光值，将检测到的荧光值减去第一个测量的荧光值以进行背景校正和标准化分析，并将差值定义为荧光增量ΔRn,同时检测12个无模板对照样本，计算其ΔRn的平均值和标准差，将所述无模板对照样本的ΔRn平均值＋3倍标准差四舍五入至整数作为结果判定的阈值，检测EGFRT790M的阈值为31228，待测样品的ΔRn高于阈值则判定为阳性，低于阈值则判定为阴性，样本检测时至少进行三次技术重复；所述待测样品为血浆浓度为50%的模拟临床样本；所述方法具备直接检测临床样本而无需核酸提取的应用价值。

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