申请/专利权人：中山康源基因技术科技有限公司

申请日：2018-08-20

公开（公告）日：2024-06-18

公开（公告）号：CN108728346B

主分类号：C12M1/34

分类号：C12M1/34;C12M1/00;G01N33/68

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.06.18#授权;2018.11.27#实质审查的生效;2018.11.02#公开

摘要：间歇式重力微流芯片杂交方法，采用间歇式重力微流芯片杂交装置，在测定的条件下进行芯片杂交反应，该装置包括盖玻片、生物探针、载玻片、杂交盒；生物探针固定于载玻片上；盖玻片的一面的四个顶角处安装有四个凸起，盖玻片的尺寸略小于载玻片的尺寸，盖玻片盖合于载玻片上，并在盖玻片、载玻片之间形成薄层，薄层内置入杂交液和含有靶序列的样本；盖玻片和载玻片的长边交界处存在用于杂交液快速流动的间隙；盖玻片与载玻片的短边交界处存在用于在悬停状态下杂交液储积的间隙；盖玻片、载玻片固定在保湿、避光的杂交盒内。本发明具有杂交高效、结构简单、成本低等优点，本发明属于生物芯片杂交技术领域。

主权项：1.间歇式重力微流芯片杂交方法，其特征在于：采用间歇式重力微流芯片杂交装置进行杂交反应，间歇式重力微流芯片杂交装置包括盖玻片、生物探针、载玻片、杂交盒；生物探针固定于载玻片上；盖玻片的一面的四个顶角处安装有四个凸起，盖玻片的尺寸略小于载玻片的尺寸，盖玻片盖合于载玻片上，并在盖玻片、载玻片之间形成薄层，薄层内置入杂交液和含有靶序列的样本；盖玻片和载玻片的长边交界处存在用于杂交液快速流动的间隙；盖玻片与载玻片的短边交界处存在用于在悬停状态下杂交液储积的间隙；盖玻片、载玻片固定在保湿、避光的杂交盒内；该方法包括如下步骤：1在载玻片上固定生物探针，并将盖玻片盖合于载玻片上，再在盖玻片和载玻片之间形成的薄层内置入杂交液和含有靶序列的样本，从而制成生物芯片杂交系统；2将盖玻片通过磁石定位、固定于杂交盒的杂交位上，并将1中制备的生物芯片杂交系统置入密封的杂交盒；3控制杂交盒与水平面垂直或形成固定角度的倾斜，保持悬停时间T，T时间后，杂交盒转动180度，再次保持悬停时间T；4重复步骤3多次。

全文数据：间歇式重力微流芯片杂交装置及方法技术领域_[0001]本发明属于生物芯片杂交技术领域，尤其涉及一种间歇式重力微流芯片杂交装置及一种间歇式重力微流芯片杂交方法。背景技术[0002]生物芯片技术起源于核酸杂交技术。核酸杂交技术可用于检测特异的DNA或RNA序列。类似的蛋白质也发展了相似的杂交检测技术。21世纪随着生物技术的发展，生物技术和电子技术相结合的产物——生物芯片诞生了。生物芯片将大量的探针分子固定于微小的载体表面，使得大量的生化反应能够一次完成，通过检测探针分子的杂交信号强度来确定样本的相关信息。生物芯片主要包括基因芯片和蛋白质芯片。基因芯片是基于核酸杂交技术发展起来的高通量高灵敏度的体外核酸检测技术。利用表面固定的探针，基因芯片可以一次性对大量基因序列进行筛查，为相关的研宂节省了大量的人力、物力、财力，因此在生物学基础研究中得到了广泛的应用。随着技术的进步，临床性质的基因芯片也开始发展，在临床诊断中发挥作用。蛋白质芯片是生物芯片的另一大类。蛋白质芯片通过将大量蛋白质分子固定于载体表面形成微阵列，利用进行标记的样本蛋白或其他分子进行反应，对芯片上各探针点信号进行检测即可分析蛋白质间或蛋白与其他分子之间的关系。[0003]芯片上大量固定的探针是其能够进行高通量反应的基础，同时也对相关的操作技术产生了要求，特别是芯片杂交效率的保证。为了在数量繁多的样本和探针之间让他们有效结合，目前主要采用薄层杂交。所谓的薄层杂交就是将固定于芯片上的探针和样本置于两层玻片之间，一般来说下层为固定了探针的生物芯片，上层为盖片，利用二者形成的薄层灌入杂交液使得探针和样本分子共处于狭小空间的杂交液中，以保证二者的有效浓度及碰撞结合几率。薄层内的杂交液为芯片上的探针分子与靶序列的结合提供了相应的缓冲体系，杂交液一般具有一定的盐浓度和粘稠度从而保证稳定的杂交体系。实验证明在静置状态下依靠分子的自然扩散进行杂交是极为低效的。目前主要的杂交方式均采用封闭式，一种是连续转动，另一种是采用人工机械进行干涉保证杂交液体在薄层内流动。连续转动法对于原位合成芯片具有一定作用，因为原位合成法芯片密度高，探针集中，因此连续转动能够帮助部分靶序列分子与探针结合，取得较好的效果。原位合成法和点样法在基因芯片上都有广泛的应用，对于蛋白质芯片，在固相表面直接合成蛋白质及其困难，因此主要采用点样法进行。对于点样法芯片，一般探针所占面积较大，单位面积内靶序列含量较少，需要进行大距离移动才能接触到对应探针，连续转动无法保证靶序列与探针的有效结合，因为一般杂交液具有一定粘度，在密闭的体系中连续转动不能有效带动薄层内杂交液流动，自然靶序列也无法接触到探针。机械干涉法由于需要使用机械，一般需要的空间较大，这就极大降低了单位体积内靶序列的浓度，需要更多的样本，同时在细微的空间内进行干涉需要专用的耗材与仪器配合，增加了杂交成本，不利于芯片技术的推广与应用。发明内容[0004]针对上述问题，本发明提供一种间歇式重力微流芯片杂交装置，它能加快生物芯片的杂交反应速度，并使得生物芯片的杂交反应更充分，同时结构简单。[0005]本发明的另一目的是提供一种间歇式重力微流芯片杂交方法。[0006]间歇式重力微流芯片杂交装置，包括盖玻片、生物探针、载玻片、杂交盒;生物探针固定于载玻片上；盖玻片的一面的四个顶角处安装有四个凸起，盖玻片的尺寸略小于载玻片的尺寸，盖玻片盖合于载玻片上，并在盖玻片、载玻片之间形成薄层，薄层内置入杂交液和含有靶序列的样本;盖玻片和载玻片的长边交界处存在用于杂交液快速流动的间隙；盖玻片与载玻片的短边交界处存在用于在悬停状态下杂交液储积的间隙;盖玻片、载玻片固定在保湿、避光的杂交盒内。采用此结构，盖玻片和载玻片的长边之间存在的间隙使得杂交液容易流动，并带动盖玻片和载玻片之间形成的薄层内的杂交液流动，且无需使用其他干扰器械，提高了生物探针和样本的接触效率，使得杂交高效而且节省成本。[0007]优选的，凸起采用硅胶材质制成。硅胶能与制备成盖片的惰性材料反应，从而容易粘贴及控制厚度；同时硅胶容易与光滑的载玻片表面存在吸附作用，以帮助固定盖玻片，防止反应过程中盖玻片的移动。[0008]优选的，盖玻片的边缘和载玻片的边缘的距离为0.5至4毫米。采用此结构，能稳定且较易将盖玻片安装于载玻片上，并使得盖玻片和载玻片保持一定的尺寸差，便于在盖玻片和载玻片的长边交界处稳定形成用于杂交液快速流动的间隙、在盖玻片与载玻片的短边交界处稳定形成用于在悬停状态下杂交液储积的间隙。[0009]优选的，盖玻片包括上层、中层、下层，在中层两端开设通孔，并在通孔内嵌入磁石，三层粘贴在一起。采用此结构，磁石密封于中央，可以防止试验时磁铁松动、磁铁被液体腐蚀。[0010]优选的，载玻片和盖玻片均采用惰性材料制成;本发明中所指的惰性材料为不吸附杂交液，且不与杂交体系反应的惰性材料。本发明中惰性材料可为玻璃或陶瓷或四氟乙烯或硅。采用此结构，接触面光滑，不吸附杂交液，且不与杂交液反应。[0011]优选的，杂交盒包括底座、密封盖、密封条，密封盖和底座一侧较接，密封盖扣合时通过密封条和底座密封连接;密封条固定于底座或密封盖上;底座另一侧安装有用于固定底座和密封盖的螺栓;底座上设有若干个杂交位，杂交位通过两个中空凸起定位。采用此结构，一次可以进行更多数量的杂交同时可以控制所有生物芯片处于相同杂交环境，且密封杂交盒简单。[0012]优选的，中空凸起内部设有用于定位的磁石;盖玻片上设有凸起的背面安装有磁石，磁石置于盖玻片的短边中央;盖玻片和中空凸起通过磁石配合实现盖玻片的自动定位。采用此结构，通过使用磁石定位，避免了滑片现象的发生，同时使得盖玻片定位和固定操作容易实现;磁石直接安装于盖玻片的另一面，安装较为方便。[0013]优选的，在每排中空凸起之间设有保湿材料。采用此结构，能保证芯片杂交时的湿度，杂交反应的速度更快，反应更充分。[0014]优选的，杂交盒采用深色材料制成，或者在杂交盒的外壁上粘贴吸光材料。采用此结构，能满足试验避光的要求，增加试验精准度。[0015]间歇式重力微流芯片杂交方法，采用上述间歇式重力微流芯片杂交装置进行杂交反应，包括如下步骤：[0016]1在载玻片上固定生物探针，并将盖玻片盖合于载玻片上，再在盖玻片和载玻片之间形成的薄层内置入杂交液和含有靶序列的样本，从而制成生物芯片杂交系统；[0017]2将盖玻片通过磁石定位、固定于杂交盒的杂交位上，并将（1中制备的生物芯片杂交系统置入密封的杂交盒；、[0018]3控制杂交盒与水平面垂直或形成固定角度的倾斜，保持悬停时间TT时间后，杂交盒转动180度，再次保持悬停时间T;^[0019]⑷重复步骤⑶多次。采用此结构，通过间歇式的重力微流杂交，能使得生物抹针的杂交反应更充分，反应速度更快。、[0020]优选的，在步骤⑶中利用杂交仪控制杂交盒的杂交温度。采用此结构，能轻松控制杂交的温度，保证杂交试验的稳定进行。_[0021]优选的，盖玻片的边缘和载玻片的边缘的距离根据薄层体积设定。、、、[0022]优选的，盖玻片上的凸起的高度根据杂交液的体积而确定;在保证足够杂交液流动空间的前提下，薄层高度应尽量低，尽量提高祀序列的有效浓度。[0023]本发明的有益效果:结构简单，操作简便;通过使用磁石定位，避免了滑片现象的发生，同时使得盖玻片的固定操作容易实现;通过间歇式的重力微流杂交方式，利用盖玻片和载玻片之间存在的尺寸差使得盖玻片和载玻片之间存在间隙，进而使得杂交液容易动并带动盖玻片和载玻片之间形成的薄层内的杂交液流动，无需使用其他干扰器械，提高了生物探针和样本的接触效率，使得杂交高效而且节省成本;敞开式的杂交使得一次可以进行更多数量的杂交，同时可以一次控制所有芯片处于相同杂交环境，操作轻松。附图说明[0024]图1为盖玻片的结构示意图。[0025]图2为盖玻片盖合于载玻片时的结构示意图。[0026]图3为杂交盒的结构示意图。[0027]图4为静置状态下的生物芯片的杂交效果图。[0028]图5为连续转动状态下的生物芯片的杂交效果图。[0029]图6为间歇式重力微流状态下的生物芯片的杂交效果图。[0030]其中，卜磁石，2-盖玻片，3-凸起，4-薄层，5-载玻片，6-密封盖，7-中空凸台，8-底座，9-锁扣件，10-保湿材料，11-密封条，12-上层，13-中层，14-下层。具体实施方式[0031]下面结合附图对本发明做进一步的具体说明。t〇〇32]间歇式重力微流芯片杂交装置，它包括盖玻片、载波片、杂交盒，将生物探针固定在载玻片上;再将盖玻片盖合于载玻片上，在盖玻片和载玻片之间形成薄层，薄层内置入杂交液和含有靶序列的样本、。从而形成生物芯片杂交系统，再将生物芯片杂交系统置入杂交盒内，利用重力微流作用并控制杂交盒周期性转动变换方向及悬停以实现加快生物芯片杂交反应速度。[0033]在本实施例中，盖玻片采用低荧光背景的显微镜载玻片经过一定处理后制成。显微镜载玻片的尺寸为75X25X1mm。将显微镜载玻片制成7〇X22X0•5mm的盖玻片，再利用硅胶在盖玻片的一面四个顶角做出四个凸起，凸起的高度为〇.〇8mm。盖玻片的另一面上在短边凸起的正对之处的中央设置磁石。本结构的盖玻片具体结构附图未展示。[0034]盖玻片还可以采用三层制作方法。具体的说，盖玻片包括上层、中层、下层，三层规格一致，在中层两端开设通孔，并在通孔内嵌入磁石，三层通过无影胶粘贴在一起。如图1所Jn〇[0035]在本实施例中，生物探针可由以下物质单独或组合组成，物质包括DNA、RNA、锁核酸、多肽、蛋白等，但不仅限于这些物质。[0036]在本实施例中，载玻片一般为平片形，可以为矩形、多边形、圆形或椭圆形等。载玻片材料一般为能够耐受杂交液的惰性材料，可以为玻璃、陶瓷、硅、聚碳酸酯等，但不仅限于这些材料。[0037]盖玻片较载玻片略小，盖玻片安装于载玻片上时，盖玻片的边缘至载玻片的边缘的距离为〇.5至4mm。盖玻片和载玻片之间形成薄层，含有靶序列的样本置入此薄层内。盖玻片和载玻片的长边交界处存在一定间隙用于杂交液的快速流动并带动二者形成的薄层内的杂交液流动；盖玻片与载玻片的短边交界处存在的间隙用于在悬停状态下杂交液的储积。在生物芯片垂直悬停时，在重力作用下，薄层内的杂交液从一个方向流向另一个方向，此时，盖玻片与载玻片长边交界处的杂交液的流动速度较薄层内的杂交液快，并带动薄层内杂交液流动，最后积聚在盖玻片与载玻片的短边交界处形成的间隙内，在表面张力作用下保持悬挂而不会滴漏。[0038]盖玻片要求接触面光滑，且不吸附杂交液、不与杂交液反应;可以采用玻璃、陶瓷、四氟乙烯、硅等惰性材料。[0039]在本实施例中，杂交盒用于为芯片反应提供合适的环境，是一个独立的密闭空间。杂交盒采用深色材料制成，或者在杂交盒的外壁上粘贴吸光材料。杂交盒包括底座和密封盖，密封盖和底座一侧较接;底座另一侧安装有锁扣件，用于固定底座和密封盖。在底座的顶端开口外围设置密封条亦可在密封盖的下端开口处设置密封条），密封盖扣合时通过密封条和底座密封连接，再通过锁扣件固定，从而保证杂交盒内部的密封性。[0040]在本实施例中，底座上有10个杂交位，分为两排，每排5个;每个杂交位通过两个中空凸起定位，中空凸起内部设有用于定位的磁石，用于与盖玻片上的磁石配合实现盖玻片自动定位。两排中空凸起之间的间隙覆盖保湿材料，用于添加保湿液保证生物芯片杂交时的湿度，保湿液体积根据杂交盒内部空间大小来确定。为保证生物芯片杂交时的湿度，也可外加保湿盒。如本实施例中杂交盒内部空间尺寸为30X20X2cm，根据测试结果添加保湿液为1.4ml，可以使得杂交取得较好结果。[0041]为了增加一次杂交反应中的芯片数量，可利用两个底座互为密封盖的做法增加杂交位，并在其中一个底座上设置密封条。[0042]采用以上描述的盖玻片与杂交盒配合发明人自己制备的分子杂交仪和肠道菌群检测芯片进行测试。载玻片尺寸为常规标准玻片，即75X25X1mm。根据盖玻片与载玻片尺寸及薄层的厚度确定杂交体积为150ul，利用杂交仪控制杂交温度为37°C，杂交盒每次运动180度，从而保证杂交盒每次与地面形成一致的角度，通过观察杂交盒运动及杂交液流动的情况确定每次悬停时间为30s，此时薄层内的杂交液可以充分流动积聚于盖玻片和载玻片的短边交界之处形成的间隙。[0043]更为具体地，杂交盒每次运动后垂直或与地面形成固定角度的倾斜，此时盖玻片与载玻片边缘的杂交液在重力作用下自然往低水平位置流动，同时带动盖玻片和载玻片之间形成的薄层之间的杂交液流动。保持一定悬停时间本实施例中为3〇s后，载玻片一端的杂交液足以流动至另一端，以保证其中的靶序列与载玻片上的探针有充足的接触几率。此时多余的液体积聚于盖玻片短边与载玻片的交界处，在表面张力作用下保持悬挂状态而不会滴漏。悬停时间可通过杂交液流动速度与倾斜角度进行计算，也可通过实验进行确认，以薄层中一端的杂交液能够流动至另一端为宜。杂交盒每次运动180度，保证盖玻片与载玻片体系与地面形成角度的一致性，因此只要控制合适的悬停时间就能够保证杂交液的充分流动从而使得杂交快速、充分进行。[0044]在图4至图6中，□标记的为大肠杆菌探针点，◊标记的为蜡样芽胞杆菌探针点〇标记的为金黄色葡萄球菌探针点。[0045]采用肠道菌群检测芯片进行杂交测试。采用肠道菌群检测系统配套的DNA提取试剂盒提取蜡样芽胞杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的基因组，之后用PCR扩增标记试剂盒对提取的基因组DNA进行扩增标记，采用Cy5进行染色，内参为试剂盒内提供，采用Cy3染色，进行杂交处理，杂交控制条件同上述记载，图像使用GenePix4000B进行扫描及数据处理。芯片上每个探针点存在三次重复，从图4、5、6中可以明显区别三种不同杂交方式的信号强度，相对于静置杂交盒连续流动杂交，间歇式重力微流杂交方式具有更高的杂交效率，定量分析发现间歇式杂交的信号强度是连续杂交的2-3倍，是静置杂交的8-10倍。由于杂交效率的提高同时可以有效避免假阳性的出现，从图中可以看出采用重力微流杂交的芯片目标探针点上样品与内参对照极为明显，肉眼即可分辨;静置杂交方式大部分探针点强度均不高，三个目标探针点中仅有一个呈现明显区别;连续转动杂交方式目标探针点存在较明显区别但是其他探针点也存在明显的颜色区别，无法很好的进行区分。[0046]上述实施例为发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

权利要求：1.间歇式重力微流芯片杂交装置，其特征在于:包括盖玻片、生物探针、载玻片、杂交盒;生物探针固定于载玻片上;盖玻片的一面的四个顶角处安装有四个凸起,盖玻片的尺寸略小于载玻片的尺寸，盖玻片盖合于载玻片上，并在盖玻片、载玻片之间形成薄层，薄层内置入杂交液和含有靶序列的样本;盖玻片和载玻片的长边交界处存在用于杂交液快速流动的间隙;盖玻片与载玻片的短边交界处存在用于在悬停状态下杂交液储积的间隙;盖玻片、载玻片固定在保湿、避光的杂交盒内。2.根据权利要求1所述间歇式重力微流芯片杂交装置，其特征在于:盖玻片的边缘和载玻片的边缘的距离为0.5至4毫米。3.根据权利要求1所述间歇式重力微流芯片杂交装置，其特征在于:盖玻片包括上层、中层、下层，在中层两端开设通孔，并在通孔内嵌入磁石，三层粘贴在一起。4.根据权利要求1所述间歇式重力微流芯片杂交装置，其特征在于:载玻片和盖玻片均采用玻璃或陶瓷或四氟乙烯或硅制成。5.根据权利要求1所述间歇式重力微流芯片杂交装置，其特征在于：杂交盒包括底座、密封盖、密封条，密封盖和底座一侧铰接，密封盖扣合时通过密封条和底座密封连接;底座另一侧安装有用于固定底座和密封盖的螺栓;底座上设有若干个杂交位，杂交位通过两个中空凸起定位。i6.根据权利要求5所述间歇式重力微流芯片杂交装置，其特征在于：中空凸起内部设有用于定位的磁性材料;盖玻片上设有凸起的背面安装有磁石，磁石置于盖玻片的短边中央；盖玻片和中空凸起通过磁石配合实现盖玻片的自动定位。、一一7.根据权利要求5所述间歇式重力微流芯片杂交装置，其特征在于:杂交盘米用深色材料制成，或者在杂交盒的外壁上粘贴吸光材料。、8.根据权利要求5所述间歇式重力微流芯片杂交装置，其特征在于:在每排中空凸起之间设有保湿材料。丄I九9.间歇式重力微流芯片杂交方法，采用权利要求1-8任一所述间歇式重力微流心片木交装置进行杂交反应，其特征在于:包括如下步骤：、、m1在载玻片上固定生物探针，并将盖玻片盖合于载玻片上，再在盖玻片和载玻片乙间形成的薄层内置入杂交液和含有靶序列的样本，从而制成生物芯片杂交系统；+⑵将盖玻片舰磁石定位、酿于杂交盒_交社，并将⑴巾_的生物芯片水交系统置入密封的杂交盒；3控制杂交盒与水平面垂直或形成固定角度的倾斜，保持悬停时间T，T时间后，水乂盒转动180度，再次保持悬停时间T;⑷重复步骤⑶多次。^社址+的、知港知i〇4艮据权利要求9所述间歇式重力微流芯片杂交方法，其特征在于:血玻片的边缘f载玻片的边缘的距离根据薄层体积设定。

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