申请/专利权人：苏州呼呼健康科技有限公司

申请日：2019-07-30

公开（公告）日：2024-06-21

公开（公告）号：CN110317875B

主分类号：C12Q1/6886

分类号：C12Q1/6886;C12N15/11

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.06.21#授权;2019.11.05#实质审查的生效;2019.10.11#公开

摘要：本发明披露了一种与肺癌相关的甲基化基因及其检测试剂盒，其中基因包括HOXA7、HOXA9、SCT以及SHOX2，其甲基化胞嘧啶位点依次标定在序列表中序列1、序列2、序列3以及序列4中。检测试剂盒包括：检测HOXA7基因的试剂，含编号1‑1、1‑2序列所示的引物及编号1‑3序列所示的探针；检测HOXA9基因的试剂，含编号2‑1、2‑2序列所示的引物及编号2‑3序列所示的探针；检测SCT的试剂，含编号3‑1、3‑2序列所示的引物及编号3‑3序列所示的探针；以及含编号3‑4、3‑5序列所示的引物及编号3‑6序列所示的探针；检测SHOX2基因的试剂，含编号4‑1、4‑2序列所示的引物及编号4‑3序列所示的探针。

主权项：1.一种与肺癌相关的甲基化基因的检测试剂盒，用于检测待测样本中的甲基化基因，其特征在于，包括：检测HOXA7基因的试剂，含编号1-1、1-2序列所示的引物以及编号1-3序列所示的探针；检测SHOX2基因的试剂，含编号4-1、4-2序列所示的引物以及编号4-3序列所示的探针；和检测SCT基因的试剂，含编号3-1、3-2序列所示的引物以及编号3-3序列所示的探针；含编号3-4、3-5序列所示的引物以及编号3-6序列所示的探针。

全文数据：一种与肺癌相关的甲基化基因及其检测试剂盒技术领域本发明涉及检测基因的试剂，尤其涉及与肺癌相关的甲基化基因及其检测试剂盒。背景技术肺结节为小的局灶性、类圆形、影像学表现密度增高的阴影，可单发或多发，不伴肺不张、肺门肿大和胸腔积液。形成肺部结节的病因很多，基本分为良性结节和恶性结节两大类，良性结节为良性肿瘤、结核病、结节病或炎性结节等。恶性结节包括肺癌及转移性肿瘤等，肺癌的发生经历增生-不典型增生-原位癌-浸润性癌等一系列阶段，其规律是起初发展较慢，待发展到一定阶段速度迅速增加。恶性肺结节中肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，根据2017年2月，国家癌症中心发布的中国最新癌症数据可知，肺癌的发病率、死亡率双率第一大中小城市的肺癌死亡率都在40％～54％之间，是第二名其它癌症双率的一倍左右，死亡率之高，位居2017年癌症之首。对于肺癌，早期诊断及早期治疗是改善预后的最有效方法，如果及早处理，早期肺癌患者可以期待更高的5年生存率，目前I期肺癌5年总体生存率可达80％。然而相对于早期肺癌患者，进展期肺癌的患者临床结局就差的多，甚至IV期的肺癌患者，总体5年生存率仅为10％左右。因此，有效地对肺部结节进行鉴别诊断，快速明确其良恶性，尽早切除恶性结节，同时避免不必要的过度治疗，是肺部结节诊断治疗的关键。近年来肺癌表观遗传学研究进展对肺癌的早期诊断和治疗具有深远的意义。有证据表明抑癌基因启动子CpG岛高度甲基化是基因失活的一个重要机制，不同基因的转录失活将影响细胞周期、DNA修复、细胞凋亡等，与癌症的发生发展有着密切联系。基因甲基化是指DNA分子上CpG双核苷中的胞嘧啶C在酶的作用下选择性地添加甲基形成5’-甲基胞嘧啶的过程。在肺癌患者中，基因启动子区的CpG岛甲基化是一个较为普遍的现象。临床认为，对肺癌患者的组织细胞和体液如痰液、血清及血浆等进行甲基化基因标志物的检测，是一项有效的肺癌辅助检测方法，具有提高肺癌检出率的价值。有研究表明，在肺癌确诊的3年前就可以从患者的痰液中检测出DNA的甲基化。如果将其与细胞病理学的检测结合起来，可大大提高肺癌诊断的效率，缩短检测周期，提高诊断的准确性。甲基化基因标志物在良恶性肺结节鉴别和肺癌诊断中有着重要意义。目前已报道的肺癌相关的甲基化基因标志物尚具敏感度低35.5％和特异性低73％的缺陷，使之应用于临床检测存在一定的局限。在此，需要简单介绍一下相关知识：甲基化基因标志物针对某一或某些癌症的敏感度高，表示相应癌症的漏诊率低；类似地，其特异性高则表示相应癌症的误诊率低。故可知，甲基化基因标志物检测的敏感度、特异性是衡量其参考价值大小的两项重要指标。综上所述，对甲基化基因标志物进行进一步深入研究，找到高敏感度、高特异性的与肺癌相关的甲基化基因及其组合的检测试剂，从而为良恶性肺结节鉴别或肺癌诊断的准确性和良好预后提供更有效的手段，是当前甲基化基因标志物检测技术中亟待解决的问题。发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种与肺癌相关的甲基化基因及其检测试剂盒，能够通过其高敏感度、高特异性为良恶性肺结节鉴别或肺癌诊断提供有价值的参考信息。为了解决上述技术问题，本发明提供了一种与肺癌相关的甲基化基因，包括HOXA7、HOXA9、SCT以及SHOX2基因中的一个或多个，其核苷酸序列依次如序列表中序列1、序列2、序列3及序列4所示；其中，基因HOXA7、HOXA9、SCT以及SHOX2的甲基化胞嘧啶位点依次标定在序列1、序列2、序列3及序列4中。为了解决上述技术问题，本发明提供了一种如前所述基因的检测试剂盒，用于检测待测样本中的甲基化基因，包括以下试剂中的一种或多种：检测HOXA7基因的试剂，含编号1-1、1-2序列所示的引物以及编号1-3序列所示的探针；检测HOXA9基因的试剂，含编号2-1、2-2序列所示的引物以及编号2-3序列所示的探针；检测SCT基因的试剂，含编号3-1、3-2序列所示的引物以及编号3-3序列所示的探针；含编号3-4、3-5序列所示的引物以及编号3-6序列所示的探针；检测SHOX2基因的试剂，含编号4-1、4-2序列所示的引物以及编号4-3序列所示的探针。优选地，检测试剂盒还包括用于内参基因检测的ACTB引物和探针。优选地，待测样本包含人体血液、肺泡灌洗液、肺泡冲洗液、痰液及肺部组织样本中的一种或多种，此外，还包含支气管刷检样本。优选地，HOXA7、HOXA9、SCT以及SHOX2基因相应的引物组分别由各自试剂中含有的引物及探针组成，在PCR反应液里各成分浓度依次为：0.2μM基因相应的引物组，0.6μMACTB引物和探针，3.5mMMgCl2、0.25mMdNTP；此外，还含有用量为100U的DNA聚合酶，用于阳性对照的非小细胞HCC827细胞系计数后提取的DNA，以及用于阴性对照的灭菌水。优选地，将检测试剂盒的试剂中的任意两个进行组合，或将试剂中的任意三个进行组合，或将四个试剂进行组合，分别构成组合试剂盒。优选地，HOXA7、HOXA9、SCT以及SHOX2基因相应的引物组分别由各自试剂中含有的引物及探针组成，在PCR反应液里各成分浓度依次为：组合中的基因相应的引物组均设为0.2μM，0.6μMACTB引物和探针，3.5mMMgCl2、0.25mMdNTP；此外，还含有用量为100U的DNA聚合酶，用于阳性对照的非小细胞HCC827细胞系计数后提取的DNA，以及用于阴性对照的灭菌水。为了解决上述技术问题，本发明提供了一种获取如前所述基因的方法，包括：对待测样本进行全基因组甲基化阵列分析，筛选出的与良恶性肺结节鉴别或肺癌相关的159种候选基因；从候选基因中选出靶标基因HOXA7、HOXA9、SCT、SHOX2，分别针对靶标基因的甲基化DNA特异性片段设计相应的引物和探针，设计的引物和探针分别等同于、互补于或杂交于序列表序列1-4中至少15个连续核苷酸或其互补序列，获取并验证符合检测要求的靶标基因的性能指标。优选地，该方法中提到的靶标基因的性能指标包括：敏感度、特异性及接受者操作特征曲线下面积AUC值。优选地，该方法中提到的待测样本包含人体血液、肺泡灌洗液、肺泡冲洗液、痰液、肺部组织及支气管刷检样本中的一种或多种。本发明提供的与肺癌相关的甲基化基因及其检测试剂盒，由于试剂盒里的试剂包括HOXA7、HOXA9、SCT、SHOX2四种甲基化基因标志物中的一种或多种相应的引物组，通过对检测样本进行全基因组甲基化阵列分析，从筛选出159个候选基因中甄选出的具特殊位点的甲基化基因标志物，其敏感度、特异性之高是已有的甲基化基因检测所不具备的，并且将这四种甲基化标志物进行不同的组合，可进一步提高其敏感度、特异性，从而能够为良恶性肺结节鉴别和肺癌诊断的准确性和预后良好提供有价值的参考信息。附图说明图1表示了本发明提供的检测甲基化基因HOXA7的ROC曲线；图2表示了本发明提供的检测甲基化基因HOXA9的ROC曲线；图3表示了本发明提供的检测甲基化基因SCT的ROC曲线；图4表示了本发明提供的检测甲基化基因SHOX2的ROC曲线。具体实施方式以下结合优选实施例对本发明的技术方案进行详细地阐述。应该指出，以下例举的实施例仅用于说明和解释本发明，而不构成对本发明的任何限制。本发明对肺癌和良性肺病患者的待测样本进行甲基化阵列分析，筛选出与良恶性肺结节鉴别或肺癌相关的159种候选基因，并从候选基因中甄选出与良恶性肺结节鉴别或肺癌相关的四种靶标基因，包括HOXA7、HOXA9、SCT、SHOX2，其中：HOXA7基因同源盒A7基因，是HOX基因家族中的一员，位于第7号染色体7P15-P14上，含2961对碱基，可编码230个氨基酸。HOXA7基因可以通过基因融合、基因沉默等方式在肿瘤中过高或过低表达，调控肿瘤细胞的发生和发展；参与肿瘤的发生，尤其是肿瘤发展的前期和后期阶段，与信号分子如MEIS、蛋白激酶-C等的相互融合参与调节生物分化与增值；与靶向基因如CAVE-OLIN-1等相互作用引发基因沉默而失活。HOXA9基因同源盒A9基因，是HOX基因家族中的一员，位于第7号染色体7P15-P14上，包含3个外显子，编码两种不同的蛋白质。HOXA9基因作为转录调节因子，既可作用于下游靶基因，发挥转录激活或抑制作用，又可与上游一系列调节蛋白相互作用，调控肿瘤的生物学行为。有研究证明，HOXA9在多种肿瘤中表达异常，可作为多种肿瘤诊断的标志物，与肿瘤的发生、侵袭转移及预后密切相关。SCT基因分泌素基因，位于染色体11p15.5，编码27个氨基酸的内分泌激素。SCT基因表达产物能够阻止细胞再进入周期分裂，抑制细胞浸润、转移和促进细胞凋亡。SCT基因在肺癌组织中高度甲基化并且可以作为肺癌和其他类型的实体瘤的潜在生物标志物。SHOX2基因矮小同源盒基因，是同源盒基因家族的一员，其基因表达调控与器官发育密切相关。研究发现，SHOX2基因在胚胎时期表达于中胚层和外胚层，对骨骼、心脏和神经系统的发育起到重要作用。另外，SHOX2基因甲基化与肺癌等肿瘤有关，作为一个常见的转录调控因子，其甲基化水平的高低影响着肿瘤发生的进程。本发明对基因甲基化水平的检测，包括：从待测样本含人体血液、肺泡灌洗液、肺泡冲洗液、痰液、肺部组织以及支气管刷检样本中的一种或多种中提取DNA，并以亚硫酸氢盐处理，然后使用甲基化特异的引物和探针进行荧光定量PCR反应；其中亚硫酸氢盐处理造成DNA双链分子那个未甲基化的胞嘧啶残基C脱氨基，成为尿嘧啶；而甲基化的胞嘧啶残基C保持不变；这样，在PCR反应中，模板上甲基化的胞嘧啶残基C位点作为胞嘧啶残基C与引物中的鸟嘌呤残基G配对，而未甲基化的胞嘧啶残基位点C作为尿嘧啶残基U与引物中的腺嘌呤残基A配对。本发明在选择临床检测常用的样本类型作为良恶性肺结节鉴别和肺癌诊断的检测样本的过程中，意外的发现以支气管刷检样本进行甲基化基因检测，肺癌诊断的敏感度和特异性达77％～95％，相较于目前临床仅采用支气管刷检样本进行细胞学涂片检测，肺癌诊断的敏感度和特异性小于35％，具有显著的提高。鉴于此，本发明除了以临床检测常用的样本类型作为检测样本外，特别增加了以支气管刷检样本作为良恶性肺结节鉴别和肺癌诊断的检测样本类型。本发明针对前述四种基因的每一种相应地设计了特异性引物对，以检测每种基因内靶区域的甲基化水平，其中靶区域分别选自序列1-4所示的DNA中连续的至少15个碱基长度的片段；本发明提供的引物对利用该甲基化差异来检测生物标志物基因内靶区域的甲基化水平。在本发明的方法中，利用荧光探针来实时监测PCR反应。所用探针5’端报告荧光基团为Cy5、FAM、TET、RoxTexasRed、HEX、Cy3以及JOE中的一个或多个。本发明的方法中对基因的甲基化水平的检测包括检测生物标志物基因中是否存在甲基化、以及对该甲基化进行定性和定量检测。本发明提供了检测与肺癌相关的基因甲基化的试剂盒，包括用于HOXA7、HOXA9、SCT、SHOX2基因中的一种或多种进行甲基化特异性PCR反应的引物对和探针。下面以具体实施例对本发明提供的技术方案作进一步详细地说明。实施例1与肺癌相关的甲基化基因的选择本发明通过对肺癌和良性肺病患者的支气管肺泡冲洗液样本进行全基因组850KIllumina甲基化阵列分析，筛选出的与良恶性肺结节鉴别或肺癌相关的159种候选基因，具体包括：NFAM1，BZRAP1，MIR142，C16ORF68，MIR365-1，SPNS1，LAT，SIX1，MAB21L1，MIR548，NBEA，BIN2，ALX1，CUX2，C11ORF21，TSPAN32，WDFY4，TRIM39，LOC728264，MIR145，HOXA9，STAB1，ARHGAP25，PRDM16，SCT，NDUFS2，FCER1G，SHOX2，ETV5，DPP10，PADI6，BAIAP2L1，MEIS1，DLGAP2，WDR66，JAM3，RBM24，RBM38，HOXD8，GBX2，DPP6，KCNIP4，SHANK2，CBLN1，SRGAP3，PCDHGA4，PCDHGC3，PCDHGA12，PCDHGA11，PCDHGA9，PCDHGA1，PCDHGB1，PCDHGC5，PCDHGB6，PCDHGB3，PCDHGB7，PCDHGA6，PCDHGA8，PCDHGA10，PCDHGA5，PCDHGB4，PCDHGC4，PCDHGA3，PCDHGA2，PCDHGA7，PCDHGB2，PCDHGC5，PCDHGB5，PCDHGC3，PCDHGB19P，MYCBPAP，HOXA7，FRR3，SPATA16，DRD5，PTCH1，SCN10A，C2CD4D，LOC100132111，YBX2，ELAVL4，GPR146，ZNF135，TFAP2E，HCN1，CMTM2，SLC12A7，TRIM58，LHX1，KCNC2，FRAT1，ESPN，RPH3AL，EN1，FAM135B，SCARF2，SLC32A1，PTCH1，LHX8，TBX1，FAT1，ARHGEF4，ZNF781，GPSM1，DUOX1，DLG4，ALX3，SYK，SLC32A1，SLC43A2，ASAM，EXOC3，SIX2，CDH4，CKB，IRX4，ZNF135，SNCB，HOXD10，RPH3AL，ISL2，HOXD3，CACNG8，ZNF529，LINC00554，GPR88，C2CD2，ZNF667，CRB2，WDR8，PRDM14，TAC1，NLFN1，MRI1，HOXD9，SRCIN1，GPR177，SLC38A1，DLX5，GPR88，CDH13，AKR7L，C4ORF39，TRIM61，PACRG，GPR6，FLJ45983，ZNF582，HLA-A，LAMA4，RGS12，HSF2BP，ZNF544，SDK1，ZNF382，MTUS1，CD52，UBXN11，LOC101929563。本发明为从上述候选基因中选出最佳的靶标基因，查阅了大量文献，筛选出已有数据证明可以有效区分良恶性肺结节和肺癌的靶标基因，再对通过文献筛选出的靶标基因进一步进行小样本荧光定量PCR反应测试，根据不同靶标基因检测临床样本的性能差异，最终从中选出HOXA7、HOXA9、SCT、SHOX2甲基化基因，如上面候选基因中字体加重的那四个。经过反复试验，本发明分别针对HOXA7、HOXA9、SCT、SHOX2基因甲基化DNA特异性片段设计检测的引物组，包括：HOXA7引物组、HOXA9引物组、SCT引物组1和SCT引物组2、SHOX2引物组；其中，每个引物组包括各自的上游引物、下游引物和探针：HOXA7引物组上游引物F：CGACGTTTACGGTAATTTGTTTTGC——序列1-1下游引物R：TCAACCGCGCCATACAACG——序列1-2探针P：TCGTTAAAGGCGTTTGCGATAAGACGGAC——序列1-3HOXA9引物组上游引物F：CGGGCGTTTTTCGTTTTAGGC——序列2-1下游引物R：AAATCCGTCCCAAACGAAACCG——序列2-2探针P：TAAATCCCCACAACTACC——序列2-3SCT引物组1上游引物F1：AGGGTTCGGCGATATTTAGAC——序列3-1下游引物R1：AACAACCGCTAAAACCGC——序列3-2探针P1：CCCTCCCGCAAACGACTAAACTCGCTAA——序列3-3SCT引物组2上游引物F2：TCGTTATAAAGGGGTTTTGC——序列3-4下游引物R2：CCTAACGAACGACTCACCT——序列3-5探针P2：TTCGGGGTCGTGGTCGTAGCGTTTAGT——序列3-6SHOX2引物组上游引物F：GTTTTTTGGATAGTTAGGTAAT——序列4-1下游引物R：TAACCCGACTTAAACGACGA——序列4-2探针P：CTCGTACGACCCCGATCG——序列4-3将上述各甲基化基因引物组中的引物序列、探针序列编号列于表1-0中。本实施例用收集的122例接受支气管镜检查的患者的支气管肺泡冲洗液作为待测样本，其中肺癌患者53例，良性肺病患者69例，从这些样本中提取DNA，并经亚硫酸氢盐处理后，分别利用相应的引物组通过荧光PCR检测HOXA7、HOXA9、SCT、SHOX2中每一个生物标志物基因内靶区域的甲基化水平，其中靶区域分别选自序列1-4所示的DNA中连续的至少15个碱表1-0名称序列编号作用HOXA7FCGACGTTTACGGTAATTTGTTTTGC1-1HOXA7上游引物HOXA7RTCAACCGCGCCATACAACG1-2HOXA7下游引物HOXA7PTCGTTAAAGGCGTTTGCGATAAGACGGAC1-3HOXA7探针HOXA9FCGGGCGTTTTTCGTTTTAGGC2-1HOXA9上游引物HOXA9RAAATCCGTCCCAAACGAAACCG2-2HOXA9下游引物HOXA9PTAAATCCCCACAACTACC2-3HOXA9探针SCTF1AGGGTTCGGCGATATTTAGAC3-1SCT上游引物SCTR1AACAACCGCTAAAACCGC3-2SCT下游引物SCTP1CCCTCCCGCAAACGACTAAACTCGCTAA3-3SCT探针SCTF2TCGTTATAAAGGGGTTTTGC3-4SCT上游引物SCTR2CCTAACGAACGACTCACCT3-5SCT下游引物SCTP2TTCGGGGTCGTGGTCGTAGCGTTTAGT3-6SCT探针SHOX2FGTTTTTTGGATAGTTAGGTAAT4-1SHOX2上游引物SHOX2RTAACCCGACTTAAACGACGA4-2SHOX2下游引物SHOX2PCTCGTACGACCCCGATCG4-3SHOX2探针基长度的片段；借此来确定这些靶标基因能否区分肺癌和良性肺病以及区分的良好性能。本发明利用荧光探针来实时监测PCR反应。所用探针5’端报告荧光基团为Cy5、FAM、TET、RoxTexasRed、HEX、Cy3以及JOE中的一个或多个。本发明使用IBMSPSSStatistics24分析软件对检测结果进行分析，通过接受者操作特征ROC，ReceiverOperatingCharacteristic曲线来比较肺癌患者和良性肺病患者的样本中每个基因甲基化的检测结果，四个甲基化基因HOXA7、HOXA9、SCT、SHOX2的ROC曲线请依次参照图1至图4。为了解释图1-图4，先要解释ROC曲线、约登指数以及AUC值的含义。ROC曲线是反映敏感度和特异性连续变量的综合指标，其纵坐标“敏感度”用于表征真阳性率，横坐标“1-特异性”则用于表征假阳性率。约登指数，它等于敏度感与特异性之和减去1，用于表示诊断试验发现真正患者真阳性与非患者假阳性的总能力，其取值范围为0～1，值越大表示诊断的真实性越强。AUC值，是指曲线下面积AUC，AreaUnderCurve大小。AUC＝0.5，指ROC曲线图上那根45度角的直线其下之面积。对于一个甲基化基因标志物来说，AUC＞0.5说明它具有检测价值。回到图1-4上来。本发明在ROC曲线上选择约登指数最大的点对应的横坐标、纵坐标来计算相应的甲基化基因对于良恶性肺结节鉴别或肺癌诊断的敏感度、特异性，如图1-4曲线上标注出的星点*；同时，计算AUC值、95％置信区间和P值P＜0.001，说明标志物检测的统计学差异显著，即可有效区分结节良恶性及是否为癌症患者。将这些数据作为人肺泡冲洗液检测上述四个甲基化基因的性能指标列于表1-1中。表1-1结合图1-4来看表1结果。首先，可以很直观地从每幅图上看出，每个基因的ROC曲线都远在AUC＝0.5的左上方，说明整体上各自的AUC值很高。再看表1，相对于良性肺部疾病，肺癌样本中的四种生物标志物基因甲基化水平的AUC值均大于0.5，在0.69～0.85之间，且均有P＜0.001，这足以说明本发明提供的HOXA7、HOXA9、SCT、SHOX2四个基因的甲基化水平的检测对于鉴别肺癌和良恶性肺结节有可信的参考价值。实施例2对设计的引物组进行验证本实施例以实时荧光PCR为例检测生物标志物基因的甲基化水平。检测目标为HOXA7、HOXA9、SCT、SHOX2基因。本实施例采用经过亚硫酸氢盐处理后的DNA为模板进行实时荧光PCR扩增来进行检测。应该说，设计优质的引物组是甲基化基因检测成败的关键性因素。本发明从设计原理上与普通的基因检测不同，要求引物序列中至少含有1个以上CpG位点，最好是含有多个CpG位点，这样可确保引物的特异性，同时可以提高甲基化基因碱基的检出率。对于HOXA7、HOXA9、SCT、SHOX2基因，可以设计多套引物和探针的组合，而每一套探针引物组合的性能均可能存在差别，所以需要通过实验来遴选和验证优劣。本实施例中，以甲基化基因模版和非甲基化基因模板对本发明设计和选拔出的引物和探针进行验证。本发明针对HOXA7、HOXA9、SCT、SHOX2基因设计的多种引物和探针，其分别等同于、互补于或杂交于序列表序列1-4中的至少15个连续核苷酸或其互补序列，其设计满足PCR扩增产物大小在80-350bp个碱基对的范围内。采用甲基化基因和非甲基化基因各自的序列作为模板对设计的各引物组如实施例1中所列五组分别通过实时荧光PCR进行基因扩增，共实施三组试验，扩增结果以Ct值表示，如表2所示。表中Ct值有数值的表示为甲基化检测为阳性，Ct值无数值的则表示为甲基化检测为阴性。表2根据表2结果可看出，在三组试验中，各引物组对于甲基化基因模板扩增Ct值均有数值，检测为阳性，而对于非甲基化基因模板扩增Ct值均无数值，检测为阴性。这表明本发明为四个甲基化基因设计和精选出的各引物组对甲基化基因模板是具有高度特异性的。实施例3以支气管刷检样本测试甲基化基因检测的敏感度和特异性本实施例选择167例接受支气管镜检查的患者中支气管刷检样本作为检测样本，其中肺癌患者95例，良性肺病患者72例。从这些样本中提取DNA，经亚硫酸氢盐处理后，选择前述HOXA7引物组、HOXA9引物组、SCT引物组2和SHOX2引物组，分别通过荧光PCR检测四种基因的甲基化水平Ct值，并通过ROC曲线来比较肺癌患者和良性肺病患者各自样本中每个基因的甲基化检测结果，在曲线上选择约登指数最大的点计算良恶性肺结节鉴别或肺癌诊断的敏感度、特异性，并计算曲线下面积AUC值。测试结果如表3所示。表3表3中的测试结果表明，以支气管刷检样本进行良恶性肺结节鉴别或肺癌诊断性能指标非常优胜，检测四种生物标志物基因甲基化水平的AUC值均大于0.88，远高于优线0.5，说明本发明提供的四个甲基化基因的具有很高的检测价值，能够为良恶性肺结节鉴别和肺癌诊断提供很有用的信息。实施例4测试甲基化基因组合检测的敏感度和特异性本实施例选择122例接受支气管镜检查的患者中支气管肺泡冲洗液作为检测样本，其中肺癌患者53例，良性肺病69例。从这些样本中提取DNA，经亚硫酸氢盐处理；分别将HOXA7、HOXA9、SHOX2、SCT基因进行组合，测试甲基化基因组合检测的性能，包括：一选择HOXA7、HOXA9、SHOX2、SCT基因中的2种进行组合，并通过荧光PCR检测各基因组合的甲基化水平，包括：组合一：HOXA7和HOXA9基因组合；组合二：HOXA7和SHOX2基因组合；组合三：HOXA7和SCT基因组合，其中SCT基因采用SCT引物组1；组合四：HOXA9和SHOX2基因组合；组合五：HOXA9和SCT基因组合，其中SCT基因采用SCT引物组2；组合六：SCT和SHOX2基因组合，其中SCT基因采用SCT引物组1。通过ROC曲线来比较肺癌患者和良性肺病患者样本中每种基因组合的甲基化检测的测试结果，选择ROC曲线上约登指数最大的点计算良恶性肺结节鉴别或肺癌诊断的敏感度、特异性，并计算曲线下面积AUC值。测试结果如表4所示。表4组合一组合二组合三组合四组合五组合六敏感度％77.7874.0774.0761.1177.7861.11特异性％75.3684.0678.2691.3075.3691.30AUC值0.8090.8280.8070.7850.8090.791据表4结果可知，以肺泡冲洗液为样本，将四个甲基化基因中的两种进行组合辅助进行良恶性肺结节鉴别或肺癌诊断其性能指标也很优胜，相对于良性肺部疾病，肺癌患者的肺泡冲洗液样本中检测四种生物标志物基因甲基化水平，其AUC值在0.785-0.828之间，均高于表1中所列之值，说明本发明提供的四个甲基化基因两两进行组合后提高了检测的准确性，其检测结果可为良恶性肺结节鉴别和肺癌诊断提供准确而有价值的信息。二选择HOXA7、HOXA9、SHOX2、SCT基因中的3种进行组合，通过荧光PCR来检测组合基因的甲基化水平，包括：组合七：HOXA7、HOXA9和SCT基因组合，其中SCT基因采用SCT引物组1；组合八：HOXA7、HOXA9和SHOX2基因组合；组合九：HOXA9、SCT和SHOX2基因组合，其中SCT基因采用SCT引物组2；组合十：HOXA7、SCT和SHOX2基因组合，其中SCT基因采用SCT引物组2。通过ROC曲线来比较肺癌患者和良性肺病患者样本中每种基因组合的甲基化检测的测试结果，选择ROC曲线上约登指数最大的点计算良恶性肺结节鉴别或肺癌诊断的敏感度、特异性，并计算曲线下面积AUC值。测试结果如表5所示。表5组合七组合八组合九组合十敏感度％70.3764.8161.1168.52特异性％88.4191.3095.6591.30AUC值0.8390.8380.8050.839据表5结果可知，以肺泡冲洗液为样本，将四个甲基化基因中的三个组合进行良恶性肺结节鉴别或肺癌诊断其性能指标也很优良，相对于良性肺部疾病，肺癌患者的肺泡冲洗液样本中检测四种生物标志物基因甲基化水平，其AUC值在0.805-0.839之间，均远高于优线0.5，且远高于表1中所列之值，说明本发明提供的四个甲基化基因将其中三个进行组合后使检测的准确性得到进一步提高，其检测结果可为良恶性肺结节鉴别和肺癌诊断提供准确可靠的信息。三选择将HOXA7、HOXA9、SHOX2、SCT四个基因进行组合，通过荧光PCR检测组合基因的甲基化水平，其中，SCT基因采用SCT引物组1。通过ROC曲线来获取肺癌患者和良性肺病患者样本中四个基因组合的甲基化检测的测试结果，选择ROC曲线上约登指数最大的点计算良恶性肺结节鉴别或肺癌诊断的敏感度、特异性，并计算曲线下面积AUC值。测试结果如表6所示。表6HOXA7、HOXA9、SCT、SHOX2敏感度％74.07特异性％88.41AUC值0.851表6结果表明，以肺泡冲洗液为样本，将四个甲基化基因组合辅助进行良恶性肺结节鉴别或肺癌诊断其性能指标也很好，相对于良性肺部疾病，肺癌患者的肺泡冲洗液样本中检测四种生物标志物基因甲基化水平，其AUC值为0.851，均远高于优线0.5，说明本发明提供的四个甲基化基因进行组合后使检测的准确性得到提高，其检测结果可为良恶性肺结节鉴别和肺癌诊断提供准确可靠的信息。实施例5与肺癌相关的甲基化基因及检测相应基因的试剂盒一种与肺癌相关的甲基化基因，包括HOXA7、HOXA9、SCT以及SHOX2基因中的一个或多个，其核苷酸序列依次如序列表中序列1、序列2、序列3及序列4所示；其中，基因HOXA7、HOXA9、SCT及SHOX2的甲基化胞嘧啶位点依次标定在序列1、序列2、序列3及序列4中。一种前述基因的检测试剂盒，用于检测待测样本中的甲基化基因，包括以下试剂中的一种或多种：检测HOXA7甲基化基因的试剂，含编号1-1、1-2序列所示的引物以及编号1-3序列所示的探针；检测HOXA9甲基化基因的试剂，含编号2-1、2-2序列所示的引物以及编号2-3序列所示的探针；检测SCT甲基化基因的试剂，含编号3-1、3-2序列所示的引物以及编号3-3序列所示的探针；含编号3-4、3-5序列所示的引物以及编号3-6序列所示的探针；检测SHOX2甲基化基因的试剂，含编号4-1、4-2序列所示的引物以及编号4-3序列所示的探针。在上述检测试剂盒中，还包括用于内参基因检测的ACTB引物和探针。在上述检测试剂盒中，HOXA7、HOXA9、SCT以及SHOX2基因各自的引物组分别由各自试剂中含有的引物及探针组成，本实施例在PCR反应液里各成分浓度依次为：0.2μMHOXA7引物组，0.6μMACTB引物和探针，3.5mMMgCl2、0.25mMdNTP；此外，还含有用量为100U的DNA聚合酶，用于阳性对照的非小细胞HCC827细胞系计数后提取的DNA；用于阴性对照的灭菌水。当然，在本实施例中例举的PCR反应液里还可以根据检测对象的不同含有其它甲基化基因引物组，譬如HOXA9引物组、SCT引物组以及SHOX2引物组，其在PCR反应液里的浓度也可相应设为0.2μM。在上述试剂盒中，在含有四组引物组组合的PCR反应液里，各成分浓度为：0.2μMHOXA7引物组，0.2μMHOXA9引物组，0.2μMSCT引物组1，0.2μMSHOX2引物组，0.5μMACTB引物和探针，3.0mMMgCl2、0.3mMdNTP；此外，还含有用量为500U的DNA聚合酶，用于阳性对照的非小细胞H1299细胞系计数后提取的DNA；用于阴性对照的灭菌水。类似地，在本实施例中例举的PCR反应液里还可以根据检测对象组合的不同含有其它形式的组合甲基化基因引物组，其在PCR反应液里的浓度也可相应设为0.2μM，如实施例4中例举的组合。本发明的试剂盒中，上述待测样本包含人体血液、肺泡灌洗液、肺泡冲洗液、痰液、肺部组织以及支气管刷检样本中的一种或多种。序列表苏州呼呼健康科技有限公司一种与肺癌相关的甲基化基因及其检测试剂盒20194SIPOSequenceListing1.016012DNAHomosapiens1ctgaagaccgcatccaggggtagatgcggaaattggcctcagccgcgccatgcagcgcgc60cctcgtccgtcttgtcgcaggcgcctttggcgaggtcactgcagagcccggggatgtttt120ggtcgtaggaggcgcagggcaggttgccgtaggcgtcggcgcccaggccgtagccggacg180caaaggggctctgataaagggggctgttgacattgtataagcccggaacggtcgaggcga240aggcgccggcgcccgccccgtagccgcttctctgtgagttgggagcaaaggagcaagaag300tcggctcggcattttggaacagagaagcccccgccgtatatttgctaaaaagcgcgttca360cataatacgaagaactcataattttgacctgtgatttgttgtccggcagctttcagtgtc420ggttttacgaggtagagtgatatatgataacattacacccccagatttacaccaaacccc480attttcttttggacggagctcgccgcagcacgtgaccgcccacatgaccgcctccgccaa540tctcagcagtcctcacaggtggtctcgctccgcagggcccgcagccgcctagaatggaag600ggcaagaggctcaaatatgcggccaaagaatccgcccgcgcccggcgggcctggcgcgtc660ccgcggaaaaagacctggaggctccgcgggagcgcccagctggcggccaacctccgcact720ggggtctgcggacgccaggcggcccggccccacgcagcaccccccaccccgcccccccgc780cgactcctgctagtgagccctggaccaagcttgggatcctccccatccctctcctgtccg840cctgcccagaccctggaagggtctctgtcccccgcaacagcctgccccgcggtggccttg900tgggcaggactcagctatgagcagatcgactctgcccaagtcttctctcacccaggtcca960gtgggcgacaggccggacttagactcggatccagacggggaaggcctcagccgcgccatg1020cagcgcgccctcgtccgtcttgtcgcaggcgcctttggcgaggtcactgcagagcccggg1080gatgttttggtcgtaggaggcgcagggcaggttgccgtaggcgtcggcgcccaggccgta1140gccggacgcaaaggggctctgataaagggggctgttgacattgtataagcccggaacggt1200cgaggcgaaggcgccggcgcccgccccgtagccgcttctctgtgagttgggagcaaagga1260gcaagaagtcggctcggcattttggaacagagaagcccccgccgtatatttgctaaaaag1320cgcgttcacataatacgaagaactcataattttgacctgtgatttgttgtccggcagctt1380tcagtgtcggttttacgaggtagagtgatatatgataacattacacccccagatttacac1440caaaccccattttcttttggacggagctcgccgcagcacgtgaccgcccacatgaccgcc1500tccgccaatctcagcagtcctcacaggtggtctcgctccgcagggcccgcagccgcctag1560aatggaagggcaagaggctcaaatatgcggccaaagaatccgcccgcgcccggcgggcct1620ggcgcgtcccgcggaaaaagacctggaggctccgcgggagcgcccagctggcggccaacc1680tccgcactggggtctgcggacgccaggcggcccggccccacgcagcaccccccaccccgc1740ccccccgccgactcctgctagtgagccctggaccaagcttgggatcctccccatccctct1800cctgtccgcctgcccagaccctggaagggtctctgtcccccgcaacagcctgccccgcgg1860tggccttgtgggcaggactcagctatgagcagatcgactctgcccaagtcttctctcacc1920caggtccagtgggcgacaggccggacttagactcggatccagacggggaaggcgcagcat1980ctcttgcagctgcagagagattgcggggtagatgcggaaattggcctcagccgcgccatg2040cagcgcgccctcgtccgtcttgtcgcaggcgcctttggcgaggtcactgcagagcccggg2100gatgttttggtcgtaggaggcgcagggcaggttgccgtaggcgtcggcgcccaggccgta2160gccggacgcaaaggggctctgataaagggggctgttgacattgtataagcccggaacggt2220cgaggcgaaggcgccggcgcccgccccgtagccgcttctctgtgagttgggagcaaagga2280gcaagaagtcggctcggcattttggaacagagaagcccccgccgtatatttgctaaaaag2340cgcgttcacataatacgaagaactcataattttgacctgtgatttgttgtccggcagctt2400tcagtgtcggttttacgaggtagag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权利要求：1.一种与肺癌相关的甲基化基因，包括基因HOXA7、HOXA9、SCT及SHOX2中的一个或多个，其核苷酸序列依次如序列表中序列1、序列2、序列3及序列4所示；其特征在于，所述基因HOXA7、HOXA9、SCT及SHOX2的甲基化胞嘧啶位点依次标定在所述序列1、序列2、序列3及序列4中。2.一种如权利要求1所述基因的检测试剂盒，用于检测待测样本中的甲基化基因，包括以下试剂中的一种或多种：检测HOXA7基因的试剂，含编号1-1、1-2序列所示的引物以及编号1-3序列所示的探针；检测HOXA9基因的试剂，含编号2-1、2-2序列所示的引物以及编号2-3序列所示的探针；检测SCT基因的试剂，含编号3-1、3-2序列所示的引物以及编号3-3序列所示的探针；含编号3-4、3-5序列所示的引物以及编号3-6序列所示的探针；检测SHOX2基因的试剂，含编号4-1、4-2序列所示的引物以及编号4-3序列所示的探针。3.按照权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括用于内参基因检测的ACTB引物和探针。4.按照权利要求3所述的检测试剂盒，所述待测样本包含人体血液、肺泡灌洗液、肺泡冲洗液、痰液及肺部组织样本中的一种或多种，其特征在于，该待测样本还包含支气管刷检样本。5.按照权利要求3或4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述HOXA7、HOXA9、SCT以及SHOX2基因相应的引物组分别由各自试剂中含有的引物及探针组成，在PCR反应液里各成分浓度依次为：0.2μM基因相应的引物组，0.6μMACTB引物和探针，3.5mMMgCl2、0.25mMdNTP；此外，还含有用量为100U的DNA聚合酶，用于阳性对照的非小细胞HCC827细胞系计数后提取的DNA，以及用于阴性对照的灭菌水。6.按照权利要求2、3及4任一项所述的试剂盒，其特征在于，将所述试剂中的任意两个进行组合，或将所述试剂中的任意三个进行组合，或将四个所述试剂进行组合，分别构成组合试剂盒。7.按照权利要求6所述的组合试剂盒，其特征在于，所述HOXA7、HOXA9、SCT以及SHOX2基因相应的引物组分别由各自的检测试剂中含有的引物及探针组成，在PCR反应液里各成分浓度依次为：组合中的基因相应的引物组均设为0.2μM，0.6μMACTB引物和探针，3.5mMMgCl2、0.25mMdNTP；此外，还含有用量为100U的DNA聚合酶，用于阳性对照的非小细胞HCC827细胞系计数后提取的DNA，以及用于阴性对照的灭菌水。8.一种获取如权利要求1所述基因的方法，包括：对待测样本进行全基因组甲基化阵列分析，筛选出的与良恶性肺结节鉴别或肺癌相关的159种候选基因；从所述候选基因中选出靶标基因HOXA7、HOXA9、SCT、SHOX2，分别针对所述靶标基因的甲基化DNA特异性片段设计相应的引物和探针，所述引物和探针分别等同于、互补于或杂交于序列表序列1-4中至少15个连续核苷酸或其互补序列，获取并验证符合检测要求的靶标基因的性能指标。9.按照权利要求8所述的方法，其特征在于，所述靶标基因的性能指标包括：敏感度、特异性及接受者操作特征曲线下面积AUC值。10.按照权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述待测样本包含人体血液、肺泡灌洗液、肺泡冲洗液、痰液、肺部组织及支气管刷检样本中的一种或多种。

百度查询： 苏州呼呼健康科技有限公司 一种与肺癌相关的甲基化基因及其检测试剂盒

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