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申请/专利权人：河北农业大学

摘要：本发明涉及一种欧美杨107杨新生嫩茎遗传转化方法，本发明通过以欧美杨107杨新生嫩茎为外植体进行农杆菌侵染，通过分别转化三种类型的过表达载体，结合PCR检测证明均获得了转基因株系，转化效率分别为16.7％、10％和6.7％，而与组培苗叶片转化方法相比，本发明遗传转化更加稳定，并且前期无需连续组培，直接以新生嫩茎为外植体，极大的克服了现有技术的不足，为107杨新品种的创制及重要性状基因的功能验证提供了重要工具，在杨树分子育种中具有重要的应用价值。

主权项：1.一种欧美杨107杨新生嫩茎遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：1外植体消毒，取欧美杨107杨当年新生嫩茎为初始外植体材料，去掉顶端过于幼嫩的茎段和末端木质化严重的茎段，将中间部位的茎段截成小段，用75％酒精溶液清洗外植体表面灰尘和杂质，再用超净水冲洗；将处理好的茎段放入无菌操作台中，先用无菌水冲洗，然后用75％的酒精溶液消杀，之后立即用无菌水冲洗外植体，并重复此过程；再将外植体放入20％的次氯酸钠溶液中消毒，之后立即倒掉次氯酸钠溶液，将外植体用无菌水冲洗，将消杀完成的外植体用无菌纸吸干水分，用手术刀截掉茎段两端接触消毒液的部分，然后接入分化培养基中进行培养；2外植体消毒后进行观察，挑选状态良好且无污染的茎段去掉两端，剔除腋芽，将茎段切成小段，接入分化培养基中预培养；3重悬液制备，将已经鉴定的含有基因NAC29、VIP3Aa和双BtBtCry1Ac、BtCry3A基因过表达载体的农杆菌菌液接种到含有相应筛选抗生素、利福平的液体LB培养基中，进行振荡培养，合格后，将摇好的菌液放入离心管中进行离心，在离心完成后倒掉上清液，加入侵染液重悬，加入AS，制备成侵染液用于侵染；4将预培养后的无菌茎段浸入预先配置好的侵染液中浸泡15min，在浸染过程中不断轻微摇晃菌液；5将侵染后的茎段取出用滤纸吸干菌液，平铺在共培养培养基上，黑暗环境下放置3天，直至茎段边缘出现小范围菌斑；6分化筛选培养，将共培养完成后将茎段转移到添加有筛选抗生素和抑菌剂特美汀的分化筛选培养基中进行分化培养，观察一周后将无污染的外植体转移到组培瓶中继续分化培养，直至长出抗性芽，期间两周更换一次筛选培养基；7抽茎筛选培养，待茎段长出大量不定芽时，将整株分化苗移至添加有筛选抗生素和抑菌剂特美汀的抽茎筛选培养基中进行抽茎培养；两周更换一次筛选培养基；3～4周抽茎；8生根筛选培养，将抽茎的小苗剪下，接种于添加有筛选抗生素和抑菌剂特美汀的生根筛选培养基中，等待其生根，做生根筛选的同时以CK做生根对照；9根据目的基因序列设计引物，选取生根良好的植株提取DNA进行PCR检测；10转化效率统计分析每个茎段外植体分化出的小苗按一个株系计算，抗性苗的株系数与预培养的外植体数量之比为转化效率。

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