申请/专利权人：汉中青钱柳科技服务有限公司

申请日：2024-01-30

公开（公告）日：2024-05-03

公开（公告）号：CN117959338A

主分类号：A61K35/413

分类号：A61K35/413;A61K31/409;C12N1/02;C12N1/06;C12N1/20;C12P1/04;C12R1/19;C12R1/37;C12R1/01

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2024.05.21#实质审查的生效;2024.05.03#公开

摘要：本发明提供了一种仿生牛胆红素结石的体外培育方法，具体涉及中医药制药技术领域。仿生牛胆红素结石体外培育方法，包括如下步骤：新鲜胆汁的收集与处理、天然菌株的获取与处理、天然菌株发酵与处理、胆汁发酵与处理、复合胆红素钙的制备、成石胆汁的制备、仿生牛胆红素结石的培育与成型、仿生牛胆红素结石的质检、仿生牛胆红素结石的包装与保存。本发明的有益效果在于：本发明培育的仿生牛胆红素结石可以达到天然牛黄的功效。本发明生产原料来源广泛且价格低廉、生产工艺简单、投资少、成本低、效益高，转化为工业生产较为简单、市场前景广阔、可产生巨大的经济与社会效益，能快速高效满足人民生命健康需求。

主权项：1.一种仿生牛胆红素结石的体外培育方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一：新鲜胆汁的收集与处理，收集1升新鲜牛、羊胆汁，按一定比例装入合适的容器中，0-4℃避光密封储存备用，使用前将胆汁平均分为2份，每份500ml。混合胆汁应检测牛磺酸含量，调节至3-7％；步骤二：天然菌株的获取与处理，从新鲜胆汁中分离纯化的菌株送检，鉴定为大肠杆菌、变形杆菌或肠球菌的分别培养后储藏于0-4℃冰箱备用；步骤三：天然菌株发酵与处理，制备肉汤培养基，将保存的大肠杆菌等菌株固体斜面37℃活化培养后，将活化的大肠杆菌或多种菌株接种于肉汤培养基中，37℃恒温、150-180rmin条件下生物恒温振荡器发酵18-24h，其活菌含量约为2-5×108个ml取出备用；步骤四：生物活性酶制备，将以上混合物低温高速12000rmin离心5分钟，弃上清并收集沉淀，用生理盐水洗涤，再离心沉淀，其沉淀物即为大肠杆菌或混合菌株的菌体。取15.0-20.0g沉淀物，加入三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液500-800ml混匀，用细胞破碎仪将菌体破碎，5000rmin离心沉淀10分钟，上清即为生物活性酶；步骤五：胆汁发酵与处理，将500ml天然牛、羊胆汁装入1L的三角瓶中，112℃灭菌20min后至常温，接种25ml制备好的大肠杆菌或混合菌株，同时按照胆汁1∶0.15-0.25的比例加入制备好的生物活性酶，置于生物恒温振荡器37℃、100-120rmin发酵40-48h，高压湿热灭菌锅内进行灭菌处理后，自然冷却；步骤六：复合胆红素钙的制备，取灭活自然冷却的发酵胆汁500ml，加入澄清饱和氢氧化钙溶液2000ml、焦亚硫酸钠10.0-15.0g，搅拌均匀，煮沸冷却后，滤出棕红色沉淀物，在棕红色沉淀物中加纯化水500ml，充分搅拌洗涤，静置后弃上清，得沉淀，按其干重每克加入：胆红素1.70-2.60g，胆酸0.30-0.71g，去氧胆酸0.12-0.35g，硫酸锌0.01-0.03g，硫酸镁0.01-0.03g，-5℃-10℃冷冻处理15-24h，之后转入真空干燥箱中，抽真空到0.035-0.045Mpa，20-30℃干燥10-24h，即得到复合胆红素钙；步骤七：成石胆汁的制备，用2L的三角瓶，取500ml的发酵胆汁，加入500g复合胆红素钙，加入0.5-0.8g硫代硫酸钠或亚硫酸钠或焦亚硫酸钠和500ml纯化水，充分搅拌后静置，制成成石胆汁；步骤八：仿生牛胆红素结石的培育与成型，用酸液调节成石胆汁，使其pH值在6.8以下，将成石胆汁抽入旋蒸仪，加入适量的促发物醋酸锌，同时将自制的灭菌棉球牛黄床置入旋蒸仪中，缓慢旋转，促发胆红素结石核心形成，然后在20-30-40-50±1℃，30-70rmin培育10-16h，静置5-10h，将棕红色球状物取出，置于低温真空干燥箱中，温度-5℃-10℃度、真空度0.015-0.045Mpa的条件下干燥30-18h，即得到体外仿生培育牛胆红素结石。

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